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宋启斌教授：生物标志与非小细胞肺癌的个体化诊断和治疗
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* n6 N/ `: c$ Y* w }3 G$ y, `2014-06-08 03:28 来源：丁香园 g! T6 e# i4 C: Y' B) j, A/ V
字体大小： 5 ~% N9 ]% q# j: p5 K
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武汉大学人民医院肿瘤中心 宋启斌 胡 胜
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宋启斌教授因事未到场，由胡胜代为报告
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3 `/ Z6 u0 j5 IPPT之二# e) A$ e, t3 u
4 H9 o) K4 ^8 \+ N6 X 摘要 TNM分期系统虽然在治疗选择、预后判断中发挥重要作用，但并不是癌症(包括NSCLC)治疗策略的完美标准。使用基因组、蛋白组技术，已经发现了多种关键基因、突变(如EGRF)和细胞内信号分子、通路——生物标志，可能与肺癌的分期、预后和药物敏感性有关，但临床使用的价值目前还未取得完全一致。联合多个生物标志，甚至以整个信号通路为标志，优化NSCLC个体化治疗进行的时代将会到来。- p- x+ H- n% B2 _4 ^
U5 a* y; e3 G 一、 肺癌的流行病学
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% X- Y* E" \6 ]/ j! k 在世界范围内，肺癌的发生率居恶性肿瘤第二位，但为恶性肿瘤死亡的首要原因。2002年全世界肺癌的新发病例为130万，几乎一半(49.9%)发生在发展中国家。估计到2020年每年新诊断的肺癌患者仍会持续升高。2007年美国新诊断的肺癌患者预计为213 380，死亡患者为160 390。我国2000年肺癌男性调整发病率为38.5/10万，死亡率33.2/10万；女性调整发病率为15.7/10万，死亡率为13. 5/10万；2000年到2005年，肺癌的发生率上升了30.5%。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌的80%，其疗效令人失望，美国5年生存率为15%，欧洲为10%，发展中国家甚至低于8.9%。复发和重要器官的转移是治疗失败的主要原因。, M' O9 Z2 m2 ?# b2 X
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二、 NSCLC个体化治疗的现状. T) _9 B D' n
, U: ?9 i# j P' y" C6 g+ q/ v 癌症个体化治疗是指根据每个患者的不同病情，制定特异的治疗方案，给予患者最适当有效的治疗，但目前的NSCLC个体化治疗还仅停留在TNM分期的层次上。& |4 n' V$ @ B. b+ b' N, Y
; W' |( ?' Q. Y' Q- k; r, V# m% [ TNM 分期系统由AJCC(American Joint Committeeon Cancer)于1958年颁布，几乎专门依据疾病的解剖学范围制定。其主要功能是提供预后信息，选择初始治疗策略；其次是在临床试验中分层患者，使医学中心之间的研究结果交流更准确。偶尔，若AJCC认为肿瘤的分级、细胞学亚型或患者的年龄可以提高预计生存的准确性或治疗反应，也会被加入到TNM系统。2 i8 c4 S& Q$ z1 M
' b8 b. E4 x O; l; u 但TNM分期系统并不能解释同样的分期和治疗方案，患者其预后差异很大甚至截然不同的现象。提示TNM分期不是选择癌症(包括NSCLC)治疗的完美标准。
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, }, j7 I& G7 n- A6 Q' U5 l 庆幸的是，目前对于预后判断和选择治疗方法，出现了新的机会。首先，依据基因表达标志的差异可将NSCLC分为预后有明显差异的亚型(独立于传统的病理学分类)，从而在分子水平上指导肺癌的个体化治疗。
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; T8 `4 ?& X. V! J 第二，与TNM提出的时代不同，新型化疗药物更有效和更广泛的使用，如紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨、培美曲赛。
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% W: \4 g# K# X. _9 c 第三，新的靶向药物，如Erlotinib (Tarceva)，Gefitinib (Iressa)和Heceptin，仅仅对具有特异分子标志的患者有效。如Gefitinib用于肺癌的治疗，疗效由EGFR基因突变、拷贝数目所决定，提示EGFR基因状态也是一种分子生物标志。& Z0 l2 q) ^. N- g- d" l
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虽然目前生物标志还没有正式加入NSCLC的TNM分期系统，但新发现的肺癌生物标志，用于NSCLC个体化治疗的研究已经取得了重大进展。可以预计，生物标志正式加入到TNM分期系统，或作为一个补充进行协同评估(co-evaluation)的时代即将到来。
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4 V4 R/ [% ]2 Y6 E" U0 M 三、 NSCLC中的生物标志4 V. r2 O: t8 t6 T2 O. Y2 A
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恶性细胞的增殖和转移一般由原癌基因激活、肿瘤抑制基因的失活和/或DNA修复机制失活导致，以及其他异常，如RNA的表达、蛋白的翻译和翻译后的修饰和功能。
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, ?1 y9 F* e" i* c+ B 因此，DNA基础的生物标志包括SNP(单核苷酸多态性)、染色体异常、DNA拷贝数目异常以及各种启动子区域的甲基化。RNA的生物标志包括，基因过表达或低表达，各种调节RNA(如小RNA、微RNA)。蛋白生物标志包括细胞膜表面分子、肿瘤抗原、蛋白磷酸化、糖基化状态。
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当然，肺癌的肿瘤生物标志也可分为血清生物标志、组织生物标志、分泌物(唾液、痰液)生物标志。血清生物标志最具吸引力，因为其在任何时候均容易获得；含有大量的生物信息(如低分子量的血清多肽组，Peptidome)。NSCLC的生物标志除了常见的CEA、NSE外，还包括生长因子及其受体、癌基因，如K-ras、EGFR和HER-2。此外，还有细胞周期特异蛋白和凋亡调节分子，如p53、Bcl2、Rb和p16INK4a。其他包括DNA修复相关分子、VEGF、干细胞因子(stem cell fator，SCF)和肝细胞生长因子(HGF)。联合多个标志比单个标志更有选择性和有效性。0 k5 ` ~+ N5 w5 z( }
尽管已发现生物标志可能与肺癌的分期或预后有关，但目前的临床使用的价值还未取得一致。但是，反应一些关键细胞内信号通路的生物标志的研究已经取得相当大的进展，尤其特异的受体酪氨酸激酶信号通路(EGFR)。- R/ H5 M1 f$ c0 Y i, }
. j+ |2 k4 A1 j1 v" S1 B6 o 四、 生物标志物与NSCLC的诊断分类
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在肺癌中，目前一个重要的方向是使用基因和蛋白微阵列(芯片)探讨癌症细胞的分子生物学特性。Sugita等用基因芯片和组织芯片检测肺癌细胞系和187例临床NSCLC标本，发现癌症/睾丸抗原(Cancer/Testis Antigens，CTAg)可以作为中央型肺鳞癌和小细胞肺癌的生物标志物，用于早期诊断和疗效监测。Inamura等对48例鳞癌使用40 386基因进行筛查，发现91个与细胞分化有关的基因在预后好的组高表达，而1 499个与翻译功能相关的基因在预后差的组高表达。
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生物标志物用于肺癌分类研究的最多的是肺腺癌(腺癌的发生率最高)。2001年，Bhattacharjee等首次使用微阵列方法对186例肺癌(127例腺癌)和17正常肺组织进行分析，发现腺癌可以再分为4类(C1、C2、C3和C4)，C1主要表达增殖相关的基因，C2神经内分泌相关的基因表达，C3主要表达鸟氨酸脱羧酶和谷胱甘肽-S-转移酶基因，C4主要表达Ⅱ型肺泡上皮标志。这种分类与临床病理也存在联系，C1大多是分化差的肿瘤，而C3、C4为分化好的肿瘤；C2居中。随后，Takuechi等对149例NSCLC(90例腺癌)进行18 175个基因表达分析，发现腺癌可以分为2类，终末呼吸单位型(TRU)和非终末呼吸单位型，前者有更高的EGFR突变和更差的预后。
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随后Beer使用微阵列技术对腺癌分析，发现使用50个基因可以将患者分为高危险和低危险2类，可以明显判断早期肺癌的生存时间。Potti等对198例早期NSCLC分析发现，使用多基因表达标签——metagene，可以预计患者是否发生复发，具有72%~79%的准确性。也有研究发现，使用128个基因的表达标签可以预计肺癌的患者是否发生转移。
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然而，微阵列在临床上使用受到限制。近来，Chen等使用RT-PCR方法分析了125例NSCLC患者，从672个具有侵袭特点基因中筛查16个与生存有关的基因，发现DUSP6、MMD、STAT1、ERBB3和LCK是5个高危险基因，是患者无复发生存时间的独立预后因子。' x% Z3 O# q) v
. K% f R9 M% x, m |0 T, k 2006年，Bild等里程碑的研究发现，完整的癌基因通路激活状态也可指导癌症的分类和靶向性治疗。作者对NSCLC的研究发现，Ras通路的状态明显与组织学亚型相关，大多数腺癌标本同鳞癌相比，存在Ras的调节异常。进一步使用聚类分析发现，可以将肺癌分为Ras通路低激活和Myc、E2F3、β-catenin和Scr高激活的组，Ras通路高激活和Myc、E2F3、β-catenin和Scr低激活的组以及Ras通路高激活和Myc、E2F3、β-catenin和Scr高激活的组，不管组织类型如何，通路高度激活组的患者有更差的预后(19.7vs51.3月)。同以前的微阵列分析多个联系不明显的基因进行癌症分类不同，完整的癌基因通路激活状态可以提供新的治疗机会。如使用多个药物或多靶点药物对全通路特异性治疗，也许可以解决目前靶向药物的联合治疗并不比单药疗效好的问题。2 ?9 G) o8 ]/ q2 Z; U
目前已有研究使用miRNA表达标志分类癌症、判断癌症患者的预后。Lu等近来研究发现，准确分类人类所有癌症仅仅需要很少的miRNA(约200个基因)。来源于不同组织的癌症使用其表达的miRNA可以归结为一类，可能导致肿瘤的分类是依据其胚胎起源而不是器官。如上皮来源的癌症，结肠、肝脏、胰腺和胃，可以归为一类；而造血细胞起源的肿瘤也归为一类。
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Takamizawa等提供了更直接的证据，在人类肺癌中，let-7存在明显下调，而且let-7表达水平低的NSCLC的患者预后更差，手术后生存时间的更短，提示let-7具有诊断意义。Nozomu等最近使用微阵列研究肺癌的miRNA的表达标志发现，miRNA与包括Ⅰ期在内的肺腺癌患者的生存时间存在联系，高mir-155和低let-7a-2表达与患者的预后差存在联系。将来，对来源于每一类肿瘤，可以建立miRNA表达文库或miRNA表达标志，指导癌症的诊断和治疗。由于miRNA可以简单的从福尔马林固定，石蜡包埋的组织中提取。
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$ a7 A' l* |/ s9 c& ` 五、 生物标志物(基因组、蛋白组标签）与NSCLC的化疗药物选择
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+ w' W) w: }) k8 T1 U$ M* v 基因组标签(Signature)开始用于癌症的分类，目前，又开始用于指导细胞毒化疗药物的选择。Dan等使用39个肿瘤细胞系分析了55种化疗药物处理后的基因表达谱，发现了50个与化疗敏感性相关的基因，提示基因组标签可以作为生物标志物预测肿瘤化疗药物的敏感性。3 a9 R$ S( T. ]* H. v" M" T
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2006年Potti等对包括肺癌细胞系的研究发现，使用微阵列分析方法，含有50个基因的表达可以预计肺癌细胞系对紫杉醇的敏感性，对于临床标本准确率可达到80%。同样，基因组表达标签也可预计其他药物，如阿霉素、5-Fu、Vp-16、CTX和拓普替康，而且还可预计联合化疗的敏感性。这些基因包括微管蛋白、TP53、亚甲基四氢叶酸还原酶、外切修复基因(ERCC4)、Rb通路基因和BCL2等。2007年，Julian等使用更新的SiRNA文库技术寻找决定紫杉醇和其他细胞毒药物敏感性的基因，样本包括NSCLC的3个肿瘤细胞系，发现了多个紫杉醇耐药的基因，包括参与纺锤体组装检验点的基因，BUB1B、AURKB；以及神经酰胺转运和合成的基因，COL4A3BP、β-葡(萄)糖苷酶基因。
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- J u" I: @/ r# T+ P 最近，Taguchi等使用血清标本的质谱分析发现了预测EGFRTKI敏感性的生物标志。作者先对139例使用gefitinib的NSCLC进行试验分析，发现了8个特异的蛋白m/z特征(生物标志)，判断预后的准确性达97.1%。然后对2个独立的使用Erlotinib或Gefitinib的人群进行确认，发现使用此标志，好预后的患者中位生存时间为207和306天，差预后的为92和107天。血清标本临床易得，所以此研究具有重大意义，为NSCLC个体化治疗的真正临床实践开启了一扇大门。
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总之，将来对NSCLC治疗的选择，也许将来应采取如下更加个体化的模式(图1)。' h c1 S/ I; Y
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图1 未来NSCLC治疗的选择
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当然，上述研究也存在不足，如未得到设计个很好的随机对照的前瞻性研究证实，而且各种微阵列的分析平台也需要统一。
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六、 生物标志物与肺癌的个体化治疗
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% m$ T" | e- f/ |7 Q6 | (一) EGFR突变与NSCLC
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9 t6 S2 m" }- H* z, o8 x% f 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)具有受体酪氨酸激酶活性(receptor tyrosinekinase，RTK)。EGFR为跨膜受体，由细胞外的配体结合区域和细胞内的酪氨酸激酶活性区域组成。EGFR的小分子抑制剂主要有2个——Gefitinib和Erlotinib，分别于2003和2004年在美国获FDA批准上市，用于对传统化疗无效的晚期NSCLC患者。
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" P7 F1 m X' i; x. i) k; O H2 e Gefitinib、Erlotinib的高敏感性与EGFR的体细胞性(somatic，不同于先天性)突变明显相关。在非选择性NSCLC标本，EGFR突变率在北美和西欧为10%，而在东亚为30%~50%。EGFR突变均发生于4个外显子中(18-21)，编码EGFR部分的酪氨酸激酶区域(全部由18-24编码)。主要突变有：外显子19的缺失(4个氨基酸：LREA)，外显子21的L858R点突变，外显子18的G719S点突变，以及外显子20的770插入突变(具体如图2)。* r5 n9 Y5 c# Z$ I4 N
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1. EGFR突变与NSCLC治疗的高敏感性3 f. R- B |6 [6 n( ?" l3 h% g; V
6 i1 d& A. ?' E$ h! [ EGFR激酶区域的突变仅限于某些亚型的NSCLC，如不吸烟的亚洲女性，组织类型为腺癌和支气管肺泡癌。有突变的患者对EGFR-TKI治疗反应更好。(图2)
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大多数回顾性研究已经发现，EGFR突变的NSCLC中，50%~80%对Gefitinib、Erlotinib有反应，而且近来来自亚洲的报道更高，超过75%，而 Gefitinib、Erlotinib不敏感的患者中突变率为7%。提示突变是Gefitinib、Erlotinib敏感性增高的原因(具体见图2)。虽然大多数EGFR突变被认为是TKI戏剧性临床疗效的基础，但约10%~20%不存在EGFR突变的患者对Gefitinib有部分反应，提示EGFR突变对TKI疗效不是一个必不可少的决定因素。其他的分子异常，如EGFR基因扩增(基因拷贝数增加)与TKI的高敏感性相关，如Hirsh等报道，高EGFR拷贝数的患者有更好的预后。( L3 G8 E5 |% m! a
进一步研究还发现，不同的突变与患者的临床治疗效果高低存在一定的联系，如外显子21点突变(L585R)与外显子19缺失性突变相比，后者可能对Gefitinib、Erlotinib有更好反应。" H. }. M1 U4 }9 G _ _; G# Q; \
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2. EGFR突变改变Gefitinib、Erlotinib敏感性的原因EGFR突变并没有影响与Gefitinib、Erlotinib结合的能力。其改变药物敏感性的原因可以通过癌基因依赖(oncogene addiction)模型来解释。
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' I0 [, K7 o% H" F7 ]4 q, {' y! p 通过Ras-Raf-MEK-ERK1/ERK2，PI3K-Akt，STAT3/STAT5通路，EGFR突变高度激活EGFR调节的抗凋亡和增殖信号，导致癌症细胞变得依赖此信号以维持其生存——即细胞具有癌基因(突变的EGFR)依赖的特征；当使用特异性TKI阻断EGFR信号后，将消除其增殖性影响和输出生存信号，导致肿瘤细胞死亡。相反，正常细胞或非EGFR依赖的肿瘤细胞(对Gefitinib、Erlotinib无反应)不受影响，因为生存还受其他基因驱使，或者在EGFR抑制后能被其他的基因通路所弥补。
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在癌基因依赖细胞，关键癌基因的急性失活(如TKI抑制EGFR)导致出现癌基因休克(oncogene shock)，即凋亡信号的输出大于生存信号，促使凋亡发生。癌基因休克可以解释：细胞毒化疗损伤细胞DNA，导致细胞周期停止——凋亡和生存信号的输出均减弱，结果细胞不再依赖某个癌基因，因此与TKI联合治疗时的疗效并不存在协同。1 Q" Z0 \8 Z: W
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对于突变导致Gefitinib、Erlotinib敏感性增高，癌基因依赖也并不完全合理解释，因为EGFR单克隆抗体cetuximab虽然可以抑制EGFR导致凋亡和生存信号输出下降，但其疗效与突变无关。而且最近发现突变后的EGFR对Gefitinib亲合力明显提高；提示NSCLC细胞存在其他的因素参与疗效差异的形成。5 s3 e( S- c) ?& s
, p# g8 C/ z$ E- V( B 3.EGFR突变与NSCLC治疗的耐药
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. z3 U1 {$ C9 @9 \ EGFR突变并不都是导致Gefitinib、Erlotinib的敏感性提高，还是EGFR-TKI耐药的原因之一。
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(1) 原发耐药% _* a! w) d% y n
% }, G# o7 U k! F6 Y* G; q 近来的研究提示，EGFR外显子20的插入性突变(D770_N771)可以使受体对EGFR-TKI的敏感性降低100倍，临床上也发现具有此突变的患者对EGFR-TKI治疗反应不明显。T790M突变很少见，大多数导致获得性耐药，但也与原发耐药相关；而且T790M突变与其他敏感性突变，如L585R同时存在时，癌症细胞对EGFR-TKI也是抵抗的。对于大多数对EGFR-TKI耐药的NSCLC而言，其肿瘤的形成很可能不是依赖EGFR导致。6 d' j8 O7 R; u. I1 B, U- ^+ \
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KRAS是EGFR下游的关键调节分子，大约15%~30%的NSCLC存在KRAS密码子12和13突变，与患者的预后差相关。有研究提示KRAS突变可能是Gefitinib、Erlotinib原发耐药的原因。一般来讲，KRAS和EGFR突变NSCLC是相互排斥的，EGFR突变主要见于不吸烟者，而KRAS突变更常见于吸烟相关的癌症。因为KRAS突变总是发生于具有野生型EGFR的NSCLC中，所以难以区分对EGFR-TKI不敏感到底是因为KRAS突变，还是因为无EGFR突变。3 y) x0 ]& N0 t* ^
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其他EGFR下游分子也与Gefitinib、Erlotinib的耐药有关。如Akt的激活是药物不敏感的一个标志。Akt的激活由PTEN基因间接调节，NSCLC中，PTEN低表达(由于启动子甲基化)与Gefitinib、Erlotinib的耐药相关。IGFR1、ERBB3和ERBB2也参与Gefitinib的耐药。然而，近来大样本研究发现，PTEN和IGFR1的状态与Gefitinib的治疗反应不相关，提示上述分子在耐药中作用还待进一步研究。
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(2) 获得性耐药$ f3 `# h4 q$ ~3 T* g8 Z
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尽管在EGFR突变的NSCLC中，Gefitinib、Erlotinib可以达到戏剧性的效果，但开始治疗后6~12个月发生的耐药明显限制了患者生存时间的延长。对耐药分子和细胞机制深入了解是将来克服耐药的关键。在开始对Gefitinib、Erlotinib有反应但后来复发的患者(具有EGFR突变)中， 存在EGFR外显子20的继发性突变——T790M，耐药的原因是突变导致EGFR结构发生变化，使TKI与其结合出现位阻效应。在50%的TKI治疗后复发的NSCLC中可以发现T790M突变。一些研究者也认为，药物治疗之前T790M突变细胞即在患者体内存在，当细胞暴露于TKI后，由于耐药而导致发挥选择作用，使T790M突变细胞数目明显增多。因此也说明原发耐药和继发耐药的区别可能仅是T790M突变细胞的多少而已。( C( ^7 {$ _$ m$ B) ~
* n6 X! h( N7 l0 J$ m+ @, ?+ D 获得性耐药其他可能的机制包括，EGFR运输的改变，突变EGFR的扩增，或者EGFR的下游信号分子的高表达，或者细胞将药物的生物活性改变了。研究已经揭示，多药耐药蛋白ABCG2可以将Gefitinib泵出细胞外，因此导致耐药；但也有研究提示，Gefitinib本身可以使ABCG2和ABC转运P糖蛋白失活。8 {3 \- Q# R# c e$ b/ }
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(二) ERCC1和RRM1与NSCLC的个体化治疗. k% I2 O' @3 i3 c* I7 Z7 N" `
+ t) j; v+ o* A 10多年前即已知道，核酸外切修复参与几种癌症的耐药，如铂类药物。ERCC1是高度保守的蛋白，维持生命活动所必需。虽然它是几个核酸外切修复蛋白中的一个，但是具有限速酶的作用。2006年，Olaussen等报道，在手术后使用铂类药物为基础的辅助化疗NSCLC中，缺乏ERCC1蛋白的患者有更好的预后。ERCC1阴性的患者，接受辅助化疗者的中位生存期比接受单纯手术者增加了14个月(56个月对42个月，P=0.002)。而ERCC1阳性者是否接受辅助化疗与生存期无关(50个月对55个月，P=0.40)；在接受单纯手术的患者中，ERCC1阳性者生存期较ERCC1阴性者长。上述结果表明，ERCC1阴性的患者更能从含铂方案的辅助化疗中获益。在DNA合成和修复中的另一个关键酶是核甘酸还原酶M1(RRM1)，早期的研究已经发现，在肺癌中，RRM1的过表达与铂类药物和吉西他滨耐药有关，2006年，Ceppi等发现，ERCC1和RRM1的mRNA水平与患者的预后差明显相关，使用GP方案化疗。2007年2月，佛州坦伯Lee Moffitt癌症中心的研究指出，接受可能治癒性手术的早期(Ⅰ期)非小细胞肺癌(NSCLC)病患中，RRM1和ERCC1同时高表达的患者(大约30%，55/184)预后良好，因此显然与以前的报道相反。- ?9 d3 c- c. {7 ] U
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但是，仔细分析RRM1和ERCC1的功能就可以合理解释，即RRM1和ERCC1在不同的阶段具有不同的角色。通过预防突变，RRM1和ERCC1可减少癌症的发生，或者阻止已经存在的肿瘤进展。因此对于未进行化疗的早期NSCLC患者，RRM1和ERCC1是预后好的标志。而对于晚期NSCLC，若进行化疗则可能导致耐药。因此，RRM1和ERCC1对于NSCLC患者治疗的选择存在2种情况：早期患者，RRM1和ERCC1高表达则可以不进行治疗；对于晚期患者，RRM1和ERCC1高表达，则不适合传统的化疗，可使用EGFR抑制剂。
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Reiman等采用免疫组化技术检测JBR10研究中265例NSCLCβ微管蛋白III的表达，发现在辅助化疗组，β微管蛋白III高表达者有更长的无复发生存期(P=0.002)，提示长春瑞滨+顺铂方案辅助化疗可能使高表达β微管蛋白III的NSCLC患者获益更多。* C7 T% Z6 O8 `0 n0 U& K
8 C1 D6 p* J) k& u. a (三)EMP-1与NSCLC的个体化治疗$ o3 X, {2 o! r) v2 {$ l
5 n1 Y# \2 |) A3 o6 y0 b Anjali等分析39例使用Gefitinib单药治疗的晚期NSCLC患者，发现低EMP-1表达的患者反应的可能性高(70%)，若EMP-1表达增加，则反应的可能性很低(5%)。临床对Gefitinib存在反应的患者基本不会表达EMP-1，而14个表达EMP-1的患者中，除一个病情稳定外，均出现疾病进展。
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分析103例非选择的肺癌患者的标本，发现鳞癌的EMP-1表达率为66%，腺癌为40.9%。分析EMP-1表达与EGFR突变之间的关系发现，表达EMP-1的患者不存在EGFR突变。
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分析Gefitinib获得耐药的患者发现，这些患者为在诊断时为BCA，开始对Gefitinib存在反应，由于存在L858R突变，Gefitinib治疗前的标本EMP-1表达很低(小于10%)，这些患者治疗160天后出现耐药，分析标本发现，患者出现了新的T790M突变，同时，EMP-1表达的表达也明显上升。提示EMP-1是Gefitinib原发和获得耐药的生物标志，而与EGFR的激酶区域突变无关。不是所有的对Gefitinib无反应的患者存在EMP-1表达，提示Gefitinib的耐药存在其他机制。; V5 K1 q7 `1 j9 k7 N7 X, T3 Y
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(四) EGFR突变与NSCLC的放疗敏感性& v: d( e6 s9 w& j$ Z; a6 X( f
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除了众所周知的SCLC和NSCLC之间存在明显的放疗敏感性差异之外，在NSCLC中相同的组织类型之间也存在明显的差异。肿瘤放疗个体化的关键是能预测肿瘤内在放射敏感性。
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在多种肿瘤(包括NSCLC)中，EGFR的激活和表达是放疗敏感性的决定因素，相反，突变功能的丢失或使用抗EGFR治疗可以增加放疗的敏感性。Amit等使用19个NSCLC细胞系，10个具有无突变的EGFR，6个为ΔE746-ΔE750缺失，3个为L858R替代。发现突变的细胞系对放射线更敏感，原因是细胞对出现的DNA双链断裂的修复延迟，凋亡增加。而且，存在对Gefitinib耐药T790M的NSCLC细胞系H1975同样对放射线敏感。9 I5 X) ?+ Z# F) Y( T
2 C: h4 x8 R. R1 c 七、 NSCLC的新生物标志——癌症干细胞4 m2 d/ \5 l; I9 \
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癌症干细胞比分化的肿瘤细胞对化疗更具抵抗性。癌症干细胞与已分化的其他肿瘤细胞可能存在基因表达谱的差异，如果能发现这些差异，不仅作为新的生物标志物用于预测肿瘤的疗效，还可作为治疗靶点。
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' }# K1 j9 j3 k( {/ c' N 体外研究已经发现，仅仅1/1000-5000 的肺癌细胞能形成新的克隆，提示不是每个肺癌细胞具有肿瘤起源的功能。Kim等发现，当小鼠暴露到肺损伤药物萘中后，少数表达了Clara 和肺泡特异标志的细胞对萘明显抵抗而且继续分裂增殖。这种细胞可以被Sca-1pos CD45neg Pecamneg CD34pos所识别，在体外具有自我更新和分化的能力，可以分化为Clara 细胞和肺泡细胞，因此被称为细支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cell，BASC)。
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LSL-K-rasG12D小鼠带有癌基因K-ras，但K-ras处于失活状态。当转导腺病毒AdCre后会导致K-ras表达，出现不典型腺瘤样增生(Ⅱ型肺泡细胞)，甚至腺瘤和腺癌。在Kim等的研究中，随着肿瘤的发生和进展，BASC的数目明显增加。提示通过持续的K-ras活化，双标记阳性的BASC为肺腺癌的起源细胞，也就是说，肺癌干细胞可能起源于BASC。* i% ]9 _. |+ C B; h, v
. R% ^- Q; ^+ q. W 研究发现，成人干细胞能通过侧群(side population，SP)表现型识别——高染料Hoechst 33342排出能力。2007年，Hung等使用流式细胞术从六个人肺癌细胞株中分离出SP细胞。移植免疫缺陷小鼠实验显示：与非SP细胞相比，SP细胞具有高肿瘤起源的能力和侵袭能力。SP细胞具有ABCG2、ATP结合转运载体的高表达，对多种化疗药物耐药；而端粒酶逆转录表达更高，提示具有无限增殖潜能。微小染色体维持蛋白7(MCM7)的mRNA水平在SP细胞中降低，提示大多数细胞处于G0静止状态。对16例临床肺癌样本分析同样发现存在的SP细胞。因此，肺癌中的SP细胞是肺癌起源细胞干细胞，其基因表达标志可能不仅是治疗的有效靶点，也是药物开发的依据。+ `; w9 I$ ]* H" y/ h) M
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