溶瘤病毒在恶性黑色素瘤中的临床应用进展

【摘要】 恶性黑色素瘤是临床上较为常见的皮肤黏膜和色素膜恶性肿瘤，尽管我国恶性黑色素瘤 发病率较低，但其发病率及死亡率均呈现快速增长态势，且晚期恶性黑色素瘤患者五年生存率仍不理想。随着人们对溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）治疗恶性黑色素瘤的基础与临床研究的深入，必将给晚期黑色素瘤患者带来更好的治疗。

溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）治疗肿瘤的概念 早在 20 世纪初就已经被提出。到了上世纪中后期， 随着新的临床试验规范的确立及病毒分离培养技术实现，开展了一大批针对恶性肿瘤的基础与临床研 究，但其安全性和疗效都受到质疑。直到 90 年代， 现代基因工程技术建立，研究者首次对Ⅰ型单纯疱 疹病毒进行基因改造成功建立 OV 株以后，一系列 临床试验业已完成，特别是 2015 年美国安进公司 Imlygic 被 FDA 批准用于治疗病灶在皮肤和淋巴结 中没能通过手术完全清除的恶性黑色素瘤，OV 疗法治疗恶性肿瘤受到了越来越多的关注。

1 OV 治疗恶性黑色素瘤的临床研究

OV 通常被定义为非致病性的病毒毒株（包括天然或经人工基因改造的病毒株），能够选择性的 感染并杀死肿瘤，而对正常的组织和细胞无害［1］ 。 至今被用于溶瘤治疗的病毒高达数十种，包括单纯疱疹病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、脊髓灰 质炎病毒、麻疹病毒、水泡性口炎病毒等［2］ 。目前 大多数病毒株都仅在体外试验中获得了良好的溶瘤作用，亦有少数病毒株有个案报道在恶性黑色素瘤患者中取得显效，如埃可病毒株 ECHO-7 （Rigvir）［3］ ，但大部分病毒都尚未进入正式临床试验阶 段。近年来在美国临床试验数据库网站（https：／ ／ clinicaltrials. gov ／）登记注册的 OV 参与恶性黑色素 瘤治疗的临床试验如表 1 所示。

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1 柯萨奇病毒 目前被用于临床试验的柯萨奇病毒（coxsackievirus，CV）病毒主要为天然病毒株 A21，CVA21能 选择性地在黑色素瘤细胞中高效复制散播，也可诱 发机体全身免疫反应；CVA21 在体外癌细胞共培养及荷黑色素瘤动物模型中都表现出明显的溶瘤活 性［4］ 。

由澳大利亚 Viralytics Limited 公司开发的天然 柯萨奇病毒株 CVA21 单独瘤内注射治疗不可切除 的Ⅲ C 期-Ⅳ 期黑素瘤 Ⅱ 期临床试验已经完成 （NCT01227551、NCT01636882 ），该试验共入组 57 例 IIIc-IV 期 M1c 黑色素瘤患者，入组患者在试验 d1、d2、d5、d8、d22 接受 3 × 108TCID50 CVA21 注射， 以后每 3 周注射 1 次共注射 6 次，后续有 16 名免疫 相关无进展生存期（immune-related progression free survival，irPFS）超过 6 个月患者治疗疗程延长至 48 周。该研究结果显示治疗耐受性良好，38. 6％ （21 ／ 57）的 irPFS 达 6 个月，中位irPFS 为 4. 2 个月，超过 6 个月持续反应率（durable response rate，DRR）为 19. 3％ ，中位反应时间（durable respond time）为 2. 8 个月，1 年生存率为 75.4％ ，随访至 16. 5 个月，中位 总生存期（overallsurvival，OS）未获得［5］ 。

1.     2 呼肠孤病毒 呼肠孤病毒（reovirus，RV）是具分节段的双链 RNA 基因组的一类病毒，其特异性破坏肿瘤细胞的 分子机制尚未完全清楚，但目前研究来看其在 KRAS 突变细胞中具有内在的复制优先性［6］ 。

目前用于临床试验的为加拿大 Oncolytic Biotech 公司开发的一株野生型 ReolysinTM （血清型 3- Dearing），其治疗Ⅳ期黑色素瘤的 Ⅱ 期临床试验 （NCT00651157）已经完成，共有 21 例患者纳入试 验，治疗 12 周期，每周期为 28 天，在每周期前 5 日 每日静脉滴注 3 × 1010 TCID50 ReolysinTM 。仅在 1 例患者因局部皮肤病灶出血行切除术后病理显示其 75％ ～ 90％ 的肿瘤发生坏死，该项研究未观察到符 合完全缓解（complete response，CR）或部分缓解 （partial response，PR）病例，中位 PFS 为 45 天（13 至 49 天），中位 OS 为 168 天（15 天 ～ 15. 8 月），由于未 能达到预期疗效，研究者终止了后续临床研究［7］ 。

1.     3 单纯疱疹病毒 目前在治疗恶性黑色素瘤的临床试验中表现出较好疗效的疱疹病毒株主要有两种：HF10 和 T-VEC （talimogene laherparepvec），均为 HSV-1 类病毒株。 HF10 是临床分离的自发突变的单纯疱疹病毒（her-pes simplexvirus，HSV）-1，其存在表达 ICP34. 5（infected cell protein 34. 5）和 ICP 47（infected cell protein 47）的基因缺失，能够降低其神经侵袭性功能［8］ 。在建立的具有免疫活性黑素瘤小鼠模型中 进行的瘤内注射试验中，注射区肿瘤与未注射区肿 瘤都发生了缩小，表明其作用机制既与直接溶瘤作用有关，也与诱导全身抗肿瘤免疫应答有关［9］ 。目 前一项瘤内注射 HF10联合伊匹木单抗（Ipilinunab） 针对不可切除的ⅢB-Ⅳ期黑素瘤Ⅱ期临床试验 （NCT02272855）已基本完成试验数据收集。该研究 入组患者需接受了 1 × 107 TCID50 HF10 瘤内注射 （共 6 次，前 4 次注射每隔 1W 注射 1 次；后两次间隔 3W）和 Ipilimumab 静脉注射（3mg ／ kg，共 4 次，每次间隔 3W），从初步结果看 HF10 与Ipilinunab 联合 应用安全性尚可，没有出现剂量限制性毒性（doselimiting toxicity，DLT），治疗相关不良事件（adverse events ，AEs）与 HF10 单用相似，大部分为 2 ／3 级 AEs，最终共有 37 例患者进行疗效评估，24 周时疾 病控制率（disease control rate，DCR）为 56. 8％ ，其中 CR（13. 5％ ）、PR（24. 3％）及 SD（18. 9％ ）［10］ 。

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T-VEC 是被 FDA 批准上市的溶瘤病毒类治疗 药物。其由 HSV-1 JS1 病毒株基础上改造而来，基 因组中删除了阻止病毒抗原提呈的ICP47 基因，并 以粒细胞巨噬细胞刺激因子（granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF）基因序列取 代了 ICP34. 5 基因，使其能失去神经毒性，可选择性 在瘤内复制且可增强抗肿瘤免疫应答［11］ 。Ⅰ期和 Ⅱ期试验（NCT02574260、NCT00289016）结果显示， 瘤内注射 T-VEC 对黑色素瘤的效果显著［12］ 。在Ⅲ 期临床试验中（NCT00769704、NCT01368276），437 例Ⅲb-Ⅳ期不可手术切除的恶性黑色素瘤患者，按 2∶ 1 被随机分配接受瘤内注射 T-VEC 或皮下注射 GM-CSF。结果显示，瘤内注射 T-VEC 和皮下注射 GM-CSF 的 DRR（16. 3 比 2. 1）％ ，客观缓解率（objective response rate，ORR）为（26. 4 比 5. 7）％和中 位 OS（23. 3 个月比 18. 9 个月），且有 15％ 的未注射 病灶出现显著旁观者效应，缩小超过 50％ ［13］ 。

1.     4 牛痘病毒 牛痘病毒 （vaccinia virus，VV）为病毒粒最大的 线性双链 DNA 病毒。18 世纪后，VV 就被用作免疫接种以预防高传染性的天花，VV 疫苗安全、有效， 且接种后不会引起人人间传播，其复制速度快、免疫 原性强、副作用明确。目前用于溶瘤病毒改造的主要有 Western Reverse 株、Wyeth 株、Lister 株和 Copenhagen 株。

目前，Jennerex 公司研发的 JX-594 已开展多项临床试验。JX-594 是将 Wyeth 株牛痘病毒的 TK 基 因替换为 GM-CSF 基因，其能在癌细胞中选择性复 制并在细胞死亡后诱导肿瘤特异性免疫。研究者在一项Ⅰ／ Ⅱ期临床研究（NCT00429312）中招募了 10 名免疫反应较强的晚期恶性黑色素瘤患者，每周给 予患者两次瘤内 JX-594 注射，疗程为 6 周，结果显 示，除两名患者未观察到反应外，其余患者均有不同 程度治疗反应，在注射部位及非注射部位均可观察 到抗肿瘤效应，并且有 1 名患者在治疗后获得手术 机会切除残余黑色素瘤后治愈［14］ 。

由于牛痘病毒基因容量大（最多可容纳 20 Kb 的外源性基因），表达效率高，因而被广泛用作外源 性基因表达载体，但选择何种外源性表达基因则需慎重，不然会导致病毒载体被清除，目前已有研究表 明，在牛痘病毒中表达 FAS-L、IL-2、IL-15、TNF 等会降低痘病毒的复制能力［15］ 。

2 挑战与对策

2.     1 设计策略与实际临床作用机制不一致

理想的溶瘤病毒治疗肿瘤的过程可以概括为：能够特异选择在肿瘤细胞内复制，进而导致肿瘤细 胞的死亡和溶解，而溶瘤释放的肿瘤抗原又能刺激 机体产生特异性抗肿瘤免疫来增强杀瘤作用，同时 释放出的子代病毒又能继续感染周围的肿瘤细胞，如此反复最终起到彻底消除肿瘤的目的。概括起来 主要为三个部分：

①肿瘤特异性靶向机制；

②病毒介 导的肿瘤细胞杀伤作用；

③抗肿瘤免疫反应的激活。

但是在实际临床应用中这三个过程的控制实现并非 尽如人意［16］ 。

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目前研究者已经初步认识到 RV 会优先作用于 具有 Ras 突变异常活化的细胞，细胞感染 RV（以及 dsRNA 的存在）会导致蛋白激酶（protein kinase resource，PKR）的活化，导致磷酸化和灭活 2 型真核反 应起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF-2β），进 而导致病毒转录的抑制，而在 Ras 突变活化的细胞 中，PKR 活化受阻因而病毒能够继续复制，因而 RV 多应用于 Ras 突变发生率高的肿瘤 ［17］ 。但是最近 一项试验发现，抑制 Ras 下游信号通路增加 PKR 活性并未影响到 RV 对肿瘤细胞的敏感性及抑瘤作 用［18］ 。OV 的直接细胞毒性的确切机制尚不明了。

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此外，抗肿瘤免疫反应的激活机制显得更为复 杂，溶瘤病毒感染肿瘤细胞能诱导淋巴细胞和抗原 提呈细胞（antigenpresenting cells，APCs）对肿瘤细 胞的浸润与活化，同时病毒裂解肿瘤细胞后释放的肿瘤抗原又可增强 APCs 的抗原递呈能力，诱导机 体产生抗肿瘤反应［19］。由于机体免疫调节的复杂 性，各类免疫细胞、免疫因子与机体其它组织细胞共 同参与调控，因而构建的各类携带细胞因子基因的 溶瘤病毒进入临床试验且取得显著疗效的少之又少。

2.2 OV 与其他疗法的联合应用

OV 概念一经提出，就获得大家的广泛关注，但从多年的临床试验结果看，单纯使用 OV 效果并不 理想，例如 T-VEC 在恶性黑色瘤的Ⅲ期临床中尽管 缩小了肿瘤体积也触发了系统性免疫反应，但却并 未显著改变 OS，因而在目前阶段 OV 疗法仍只能作 为辅助治疗手段之一，与其他治疗方法的联合是提 高其疗效的必然途径。

2. 2. 1 联合化疗：从目前 OV 作用机制来看，诱发机体的抗肿瘤免疫反应是其发挥作用的关键环节， 以往研究认为化疗在杀伤肿瘤细胞的同时会抑制机 体免疫系统，虽然目前已有研究表明通过化疗药物 的提前预处理，可以打破机体的免疫耐受状态，现仍在探索之中，因而 OV 治疗的临床试验中选取的入 组病人也多为免疫反应较佳病人，与化疗药物合用 较少。目前一项 ReolysinTM 与紫杉醇、卡铂联用治疗 Ⅳ期黑色素瘤的Ⅱ期临床试验（NCT00984464）也已 完成，该试验有 14 名患者参与试验，其 ORR 为21％ ；PFS 和 OS 中位数分别为 5. 2 和 10. 9 个月；1 年生存率为 43％ ，其中 DCR 为 85％［20］ 。

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2. 2. 2 联合免疫检查点抑制剂：目前免疫检查点抑 制剂细胞毒 T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic Tlymphocyte associated antigen 4，CTLA-4）抗体，程序性死 亡受体-1（programmed death 1 ，PD-1）／细胞程式死 亡配体-1（programmedcell death 1 ligand 1，PD-L1） 抗体已在临床上用于一系列恶性肿瘤，其治疗恶性黑色素瘤疗效显著［21］ 。也有研究数据表明，OV 可 以调节 PD1 ／ PD-L1 在癌细胞上的表达，这奠定了 两者联合使用的理论基础［22-23］ 。从 T-VEC 与Ipilimumab 联 用 治 疗 恶 性 黑 色 素 瘤 的 临 床 试 验 （NCT01740297）发表的数据看安全性与疗效尚可，该试验一共入组 217 名ⅢB-Ⅳ期恶黑患者，19 名被 纳入安全性分析的患者中没有出现 DLT，有 26. 3％ 的患者出现 3 ／ 4 级 AEs，其中 15. 8％ 的 AEs归因于 T-VEC，21. 1％ 的 AEs 归因于 Ipilimumab；ORR为 50％ ，44％ 的患者反应持续时间大于 6 个月，18 个 月 PFS 为 50％ ；18 个月的 OS 为 67％ ［24］ 。目前Ipilimumab 联合 CVA21（NCT02307149）、PD-1 单抗联 合 T-VEC （NCT02263508）、PD-1 单抗联合 CVA21 （NCT02565992）治疗恶性黑色素瘤的临床试验也正 在进行之中［25］。

2. 2. 3 联合靶向药物：目前小分子靶向药物 B-Raf 抑制剂、MEK 抑制剂也已通过 FDA 审批用于无法 手术根治的 B-Raf 基因突变的晚期黑色素瘤。有研 究认为，黑色素瘤中 B-Raf 突变率在 40％ 左右，而针 对 B-Raf 突变的靶向治疗作用可能与肿瘤微环境 T 细胞的炎症聚集有关，因此 OV 与B-Raf 联用便有 了理论上结合的可能性［26］ 。已有一项针对 B-Raf 突变的患者运用 T-VEC 联合 B-Raf 抑制剂或 MEK 抑制剂的临床试验（NCT03088176）于 2017 年6 月 25 日开始招募病人入组。

2.3 OV 治疗的疗效评估

传统的 WHO 标准与 RECIST 标准均以肿瘤大 小变化评价疗效，实际上追求的都是“无瘤生存”。 随着靶向药物、免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒治疗等 新的治疗方式的出现，迫切需要新的评价指标，因而新药及新方法的作用机制决定未来可能以“肿瘤稳 定”和“延迟复发”作为疗效评价指标可能更为合 适。由于 OV 感染肿瘤的早期阶段可能没有明显得 瘤体改变，甚至可能由于肿瘤内部出血或免疫细胞 浸润导致影像上的增大，因而可能会被误认“疾病 进展”而终止治疗。而被用于免疫治疗疗效评估的 多种评价体系如免疫相关缓解标准、修改版免疫相关缓解标准、Choi 标准以及 PET 实体瘤疗效标准， 其在临床上的应用普及尚需进一步研究。

3 结语

近年来，晚期恶性黑色素瘤的治疗取得了巨大进展，而 OV 作为新型治疗方式能否成为其中新的 突破尚需深入研究。其既需要更为深入的开展基础 研究，以解决靶向性较差问题，又需要进一步优化临床试验方案，开展更为广泛地联合其他治疗方案的临床试验，以解决单独应用溶瘤病毒治疗肿瘤效力 较低的现状。