急性白血病多药耐药免疫逆转策略研究进展

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白血病治疗的目的是清除白血病克隆重建正常骨髓造血。目前，化疗已成为白血病最主要的治疗方式，但复发率较高。抗肿瘤药物疗效受到三个方面因素的限制:①到达靶细胞的化疗药药物代谢动力学特征;②对体内正常细胞和组织的杀伤;③肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。后者是治疗白血病面临的主要问题。用一种化疗药物作用肿瘤细胞后，肿瘤细胞不但会对该药产生耐药，同时有可能对其他结构和分子靶点不同的多种药物产生耐药，称之为多药耐药( Multidrug resistance，MDR) ［1］。 MDR 仍然是导致血液肿瘤化疗失败和患者死亡的最主要原因之一。近年来，免疫治疗作为逆转多药耐药的方法之一，因其副作用小，应用前景广等优势引起了国内外研究者的广泛关注。

肿瘤细胞多药耐药主要机制是由通过外排泵降低细胞内的药物浓度起作用。白血病经典的耐药机制主要涉及 ATP 结合盒(ATPBinding Cassette)膜载体蛋白家族。主要包括 ABCB1 ( P-糖蛋白) 和 ABCC1(MDR 相关蛋白)，还有一个核质分之转运蛋白———肺耐药蛋白 ( Lung resistance protein， LRP) ［2］。

1 急性白血病多药耐药蛋白

1． 1 ABCB1 蛋白( P-glycoprotein，P-gp) ABCB1 蛋白是位于第 7 号染色体上由 abcb1 基因编码的糖化蛋白，P-gp 为研究最广泛的 ATP 依赖的“外排泵” ［3］。它是 1976 年 Juliano 等［４］在中国仓鼠卵巢细胞株的胞膜上发现的一种分子大小为 170 kD 的跨膜蛋白及 p170。这种蛋白是 ATP 结合家族的一员，是能量依赖性药物转运泵，能将疏水亲脂性药物泵出细胞外，而导致细胞耐药。部分药物在未进入细胞之前，在胞膜上与 p170 结合，而无法进入细胞。 P-gp 既可增加药物排出，又可降低药物流入。 P-gp 易使肿瘤细胞产生经典 MDR 药物多为天然的相对分子质量较大的亲脂性药物如阿霉素、柔红霉素、放线菌素、长春碱类、紫杉醇类、替尼泊苷和依托泊苷等抗肿瘤药物［5］。有研究显示，ABCB1 蛋白可能参与炎症过程中的免疫应答反应［6］。 ABCB1 蛋白在一些免疫系统细胞中表达，并且和一些细胞因子的转运有关，如:IL-2、IL-４和 IFN-γ ［7，8］。 ABCB1 蛋白的表达对肿瘤化疗疗效起着重要作用:①ABCB1 在几类肿瘤中高表达显示出明显的耐药性;②化疗后的耐药伴随着 ABCB1 蛋白的水平的增高;③在某些肿瘤中 ABCB1 蛋白水平用于预测预后［9］

1． 2 ABCC1(多药耐药相关蛋白-MRP1) ABCC1 (Multidrug resistance-associated protein 1，MRP1) 也是 ATP 依赖的转膜蛋白，由位于 16 号染色体 p13 上abccc1 基因编码［10］。 ABCC1 蛋白是第一个发现的 ABCC 亚家族成员，大小为 190 kD ［11］，几乎分布于所有组织中。它转运疏水阴离子和还原型谷胱甘肽共轭的有机阴离子、葡萄糖苷酸以及硫酸盐等。 ABCC1 的生理功能是排除正常代谢产物和外源有毒物质如化疗药，是目前与白血病耐药关系最为密切的耐药通道之一。研究表明:MRP1 介导多种急性白血病常用药物耐药转运，包括长春碱、长春新碱、依托泊苷、甲氨蝶呤、阿霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、环磷酰胺以及亚砷酸盐等［12］。

ABCC1 介导的多药耐药机制可能是 ABCC1 识别并转运与谷胱甘肽(Glutathione，GSＨ) 偶合的底物，这种共转运机制被相关研究证实，显示当 GSＨ缺失或合成受到抑制时，ABCC1 降低了对相关底物的转运作用［13］。临床研究亦发现:在 AML 患者中， MRP1 的高表达与白血病耐药及复发有密切关系。同时，还有些研究显示 ABCC1 的表达和白血病的耐药没有相关性，这可能是因为有些肿瘤共同表达 ABCB1 和 ABCC1，而白血病也表达多重耐药蛋白，这些蛋白共同引起了白血病 MDR。

1． 3 肺耐药相关蛋白 ( Lung resistance protein， LRP) 是在具有 MDR 的肺癌细胞中发现的，基因 lrp 位于 16 号染色体 P11 上，编码分子大小为 110 kD 的非糖类蛋白质。 LRP 是细胞穹窿体的主要蛋白成分，它可能由两种机制引起 MDR:一是通过核靶点屏蔽机制使以细胞核为靶点的药物不能通过和进入细胞核而引起耐药;二是它可使胞质中药物进入运输囊泡，并通过胞吐作用排出细胞外［1４］。研究表明:在一些实体瘤中 LRP 的过度表达和一些化疗药的耐药有关，如阿霉素、长春新碱、依托泊苷、紫杉酚等。而在血液恶性肿瘤中，病情的恶性程度和 MDR 表型有着正相关性，LRP 在儿童急淋中高表达［15］。在 AML、MM 以及弥漫大 B 淋巴瘤中 LRP 的表达导致肿瘤细胞的 MDR，并且患者的平均寿命也相应缩短［16］。 LRP 的表达和 MDR 的关系一直存在争议，最新研究强调 LRP 可能是通过胞外生长因子 PI3K/ AKT 信号调节 MDR ［17］。在血液肿瘤中，Raf 和 AKT 通过刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡和加速恶性克隆来引起 MDR 的产生［18］。

2 免疫机制逆转多药耐药

大部分化疗药不能消灭多药耐药肿瘤细胞，而肿瘤细胞的免疫耐受和对化疗药物的多药耐药机理不相关，故可以将免疫疗法和化疗药相结合用于治疗多药耐药肿瘤。免疫化疗法是联合细胞毒素剂和免疫治疗，使其发挥各自最佳的治疗效果。免疫化疗法主要用于传统化疗药治疗效果不佳的恶性肿瘤，包括血液恶性肿瘤、淋巴瘤和白血病等。以 B 细胞为靶点的 CD20 单抗(利妥昔单抗)联合细胞毒药物氟达拉滨和环磷酰胺用于治疗慢性淋巴细胞白血病［19］。还有人将抗 CD52 单抗(阿伦单抗) 联合氟达拉滨和环磷酰胺以及利妥昔单抗用于慢性淋巴细胞白血病的治疗。一些化疗药物在特殊条件下能增强抗肿瘤免疫，主要通过增加肿瘤细胞的免疫原性，降低免疫紊乱，或者诱导肿瘤细胞凋亡从而提高抗肿瘤免疫(主要通过激活抗原递呈细胞)。蒽环类药物阿霉素和伊达比星等诱导肿瘤细胞凋亡，增强了树突状细胞对肿瘤相关抗原的摄取，促使 DC 细胞的成熟，提高抗原递呈能力，激活了抗捕获肿瘤抗原的原位免疫效应。大部分化疗药物由于肿瘤耐药的原因达不到细胞毒的药效剂量，但通过联合免疫细胞能够增强抗肿瘤免疫效应来杀死 MDR 肿瘤细胞［20］。为了提高免疫化疗治疗 MDR 肿瘤的疗效，首先要选用能提高抗肿瘤免疫作用的细胞毒药，其次要用能减低肿瘤相关免疫紊乱的化疗药物。本文主要通过细胞因子、特异性抗体、免疫细胞及免疫抑制剂等对多药耐药逆转的研究进行综述。

2． 1 细胞因子 近年来，逆转多药耐药已经成为肿瘤化疗一个新的研究方向，细胞因子逆转多药耐药已引起国内外科学家的高度关注。研究表明，很多细胞因子都能起到多药耐药的逆转作用，从而明显提高了肿瘤临床治疗效果。将 TNF-α、IFN-γ、IL-2 加入到结肠癌细胞株中培养，mdr1 基因表达下调，癌细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性也增强［21］。贾庆瑞等［22］以 IL-2 与化疗药物合用治疗急性白血病患者，与单用化疗药物患者相比，白血病细胞 Pgp 及 LRP 表达减低，可以显著增强化疗效果。平宝红等［23］实验证实，IFN-α 能提高K562 / AO2 细胞内药物的浓度，恢复化疗药物的细胞杀伤作用，但对 P-糖蛋白及多药耐药基因 1 及其 mRNA 的表达没有明显影响，这一研究表明 IFN-α 能增强化疗药物对耐药肿瘤细胞的细胞毒作用。

2． 2 特异性抗体MDR 的表达已经成为急性髓系白血病治疗过程中非常棘手的难题，针对 MDR 抗原表位制备特异识别的单克隆抗体，应用于临床还有待进一步的研究。 Mizukoshi 等［2４］报道的一项Ⅰ 期临床试验中，12 例肝癌患者接受MRP3 衍生蛋白治疗(因其能够激活 MRP3 特异性 T 细胞，起到抗原-抗体的免疫反应)，其中 9 例达到病情稳定，中位生存时间为 1４个月，均未见严重不良反应。

90% 以上急性髓系白血病表达 CD33，吉妥单抗 ( Gemtuzumab ozogamicin， GO ) 为抗肿瘤药物 Calicheamicin 和人抗鼠 CD33 单克隆抗体的偶联物，用于 AML 的治疗。体外实验显示:多药耐药蛋白 P-gp 将 Calicheamicin从 AML 细胞株中泵出体外，而 GO 与 CD33 抗原结合后，形成的细胞表面复合物可被靶细胞迅速内吞，被靶细胞内吞的偶联物的双功能链随即在胞内酸性条件下断裂，水解释放 CLM，而高亲脂性的 CLM 可进入细胞核内产生细胞毒效应，导致肿瘤细胞凋亡［25］。然而，由于 GO 的连接器的不稳定导致细胞毒素的脱靶或药物传送区域限制的原因，临床疗效的有限以及出现少数的不良事件导致 GO 的退市。针对 GO 的缺点， SGNCD33A 明显的改进了偶联技术，使用能精确负载相同药载量单抗的偶联物( Antibody-drug conjugate，ADC)。它通过可分裂的蛋白酶二肽将抗 CD33 抗体mAb 和 Pyrrolobenzodiazepine(PBD)连接，PBD 能和 DNA 交联，引起DNA 的损伤导致细胞周期停滞和细胞凋亡，有望引起药物吸收的最大化并且提高药物的细胞毒性。临床前研究显示:无论是在 MDR阴性或阳性的 AML 细胞株和AML 小鼠模型中， SGN-33A 均有高效的裂解和杀伤活性［26］。

另外 CD1４7 为细胞表面糖蛋白，在肿瘤细胞中高表达，调节肿瘤细胞的生长，并诱导肿瘤细胞的多药耐药。 CD４４是主要的透明质酸受体，也具有多效性，介导细胞的黏附、增殖、分化、迁移以及多药耐药等，是涉及到肿瘤发病机理的细胞外基质主要元素，靶向 CD４４和 CD1４7 的抗体能使 MDR 细胞对细胞毒药物更敏感［27］。

2． 3 免疫细胞

2． 3． 1DC-CIK 树突状细胞(Dendritic cells，DC)是专职抗原递呈细胞，能有效地捕获、加工处理和递呈抗原，诱导抗原特异性细胞毒 T 淋巴细胞反应 (Cytotoxic T lymphocyte，CTL)。细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cell，CIK) 是同时具有 T 淋巴细胞抗瘤活性和 NK 细胞非主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MＨC)限制性的杀瘤的特点，其增殖能力强、杀瘤活性高、杀瘤活性广谱，依靠其细胞毒性和分泌的细胞因子发挥其抗肿瘤的作用［28］。 DC 和 CIK 两者的作用机制高度互补，联合应用提高了急性白血病的治疗效果，并且对白血病多药耐药有明显的逆转作用。

苏荣英等［29］以 P-gp 为经典耐药机制作为切入点，将 DC-CIK 与白血病多药耐药株(K562 / ADR)细胞共培养，结果表明， DC-CIK 对 P-gp 高表达的 K562 / ADR 耐药细胞株具有特异性的细胞毒作用，有效提高了细胞内的 ADR 含量，下调了 P-gp 和 MDR1 的表达。DC-CIK 细胞较 CIK 细胞更能提高多药耐药细胞对阿霉素的敏感性，抑制其增殖，证明了免疫效应细胞体外逆转多药耐药的作用。有研究显示，DC 细胞可以通过竞争性抑制 P-gp 上 ATP 位点，影响其 ATP 泵功能，使化疗药物外排减少。 DCCIK 在培养过程中分泌细胞因子如 α-INF、TNF-α、 IL-2 等，这些细胞因子可通过改变细胞膜的脂质组成或影响 P-gp 的活性来增强肿瘤细胞对化疗的敏感性，这些细胞因子还具有促进肿瘤细胞凋亡的作用［30］。另外还有研究显示，免疫效应细胞可以损伤 MDR 细胞的细胞膜，导致药物外排泵受到破坏，Pgp 的表达下调，使耐药肿瘤细胞内化疗药物浓度增高，从而逆转 MDR。

有研究表明，免疫效应细胞通过释放的穿孔素等物质损伤耐药靶细胞膜，破坏药物外排泵，使 Pgp 表达发生下调，细胞内化疗药物的积累增加，逆转靶细胞的耐药性。研究者发现免疫效应细胞对耐药肿瘤细胞的杀伤力明显高于其药物敏感株，考虑可能是由于 MDR 肿瘤细胞耐药蛋白的过度表达增强了靶细胞的免疫原性，因而易于成为免疫效应细胞攻击的靶点，从而产生破坏耐药蛋白的功能［31］。 2． 3． 2 CAR-T 细胞嵌合抗原受体 ( Chimeric antigen receptor，CAR)疗法作为免疫治疗的新领域获得了令人鼓舞的结果℃ AR-T 是通过基因工程技术将肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigen，TAA)结合区域、铰链区域、跨膜区域和胞内信号区域结合为一体，利用该融合基因修饰的 T 细胞。它既能够特异识别并结合抗原，又具备 T 细胞杀伤能力。基于 CAR-T 的设计原理，CAR-T 在肿瘤的免疫治疗中拥有很多独特的优势:首先 CAR-T 细胞以非ＨLA 分子限制的模式识别肿瘤抗原，这使得 T 细胞绕过抗原提呈细胞的抗原递呈，克服了肿瘤细胞ＨLA 分子表达下调的免疫逃逸直接杀伤肿瘤细胞;其次， CAR-T 可以特异识别蛋白、糖类以及脂类抗原，扩大了作用靶点范围;同时，应用广泛活化后的 CART 细胞能够分泌很多细胞因子来对抗免疫抑制的肿瘤微环境，提高 T 细胞的抗肿瘤效应［32］。

目前，抗 CD19 的 CAR-T 已经在 B 淋巴细胞白血病中有显著的疗效，如 Maude 等［33］应用 CAR-T 细胞治疗 30例复发/ 难治急性淋巴细胞白血病患儿，其中 90% (27 例)完全缓解，持续缓解 6 个月的无事件生存率为 67% ，即使干细胞移植失败的患者亦可持续缓解达 2４个月℃ AR-T 也有根治 AML 的潜力，但多数 AML 细胞与造血干细胞或祖细胞有共同抗原，限制了其应用。 Kenderian 等［3４］临床前研究报道了 CART33 细胞单独或联合化疗药有良好的抗 AML 细胞效应。尤其是 CD123 与癌细胞的抗凋亡有关，能够增加癌细胞的扩增，同时也是不良预后的危险因素，可能成为治愈 AML 的一个潜在靶点。

细胞内蛋白 WT1 在多种急慢性白血病和实体瘤细胞中过表达。 Rafiq等［35］使用 ESK1 TCRm 作为 CAR，能特异杀伤 WT1-ＨLA-A∗02:01 阳性的多种肿瘤细胞，提示 CAR-T 细胞免疫可靶向肿瘤细胞内蛋白抗原，这为白血病多药耐药蛋白靶向治疗提供新的思路。可以设计靶向 P-gp、MRP 或 LRP 蛋白的 CAR-T细胞，为逆转白血病多药耐药提供更有力的手段。

2． 4 免疫抑制剂-环孢菌素 A 环孢菌素 A(Cyclosporine A，CsA)是最早用于耐药逆转研究，且在体外实验效果最好的经典药物之一。目前比较公认的 CsA 逆转 MDR 的机制是:CsA 作为一种高度亲脂类药物，它与抗肿瘤药物竞争 P 糖蛋白的结合位点，抑制 P-gp 将抗肿瘤药物的外排作用，提高细胞内抗肿瘤药物浓度而逆转耐药［36］。 CsA 可下调 mdr1 的表达来降低 p170 的表达进而逆转 MDR，其作用可能与 CsA 抑制蛋白激酶 D(PKC)活性有关。提示 CsA 可能通过抑制 PKC 活性，降低 P170 磷酸化来降低其泵药物功能。同时，CsA 作为免疫抑制剂广泛应用于血液系统疾病的治疗，CsA 的免疫抑制作用是通过胞浆受体或细胞因子编码基因转录所需的重要的核蛋白的相互作用来实现对 T 细胞活化的早期阶段的抑制℃ sA 的逆转耐药作用可能是与 mdr1 基因转录过程中所需核蛋白相互作用有关。故 CsA 作为免疫抑制剂在治疗血液肿瘤过程中可能发挥更为重要的作用。其免疫抑制作用和逆转多药耐药作用两者之间是否存在关联有待于深入的研究和探讨。

3 总结

免疫治疗有望成为逆转白血病多药耐药有力手段，许多免疫疗法在 ALL 中治疗取得了较理想的疗效，而多数 AML 细胞与造血干细胞或祖细胞有共同抗原，免疫治疗 AML 还面临着巨大挑战。理论上，针对白血病多药耐药干细胞的免疫治疗将有望治愈白血病。 MDR 基因的表达可以作为多药耐药肿瘤免疫治疗的潜在靶点。在将来，免疫疗法将根据患者的遗传学危险分层和免疫表型等因素制定个体化治疗方案，细胞治疗的时机、剂量、次数、抗肿瘤效应的调控、有效评估系统的界定也是必须考虑的因素。同时，CsA 在治疗血液病中除发挥免疫抑制作用外也具有逆转耐药的功能，两者之间是否存在一定的内在联系还有待于进一步的探索。此外，细胞免疫治疗与造血干细胞移植以及化疗药物的联合等问题均需要大量的临床前研究及多中心的大样本临床试验进一步研究。随着对 MDR 机制的研究和对抗肿瘤免疫治疗的指导原则的理解，白血病多药耐药的个体化治疗以及联合治疗方案的实施将得到快速发展。本文对急性白血病多药耐药的免疫治疗现状进行了综述，为免疫治疗大规模应用于血液系统恶性肿瘤的多药耐药逆转提供新的思路和方向。