ＢＲＣＡ数据解读中国专家共识

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本帖最后由虎光着于 2018-8-3 16:20 编辑

乳腺癌易感基因（ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅ，ＢＲＣＡ）是重要的抑癌基因与肿瘤易感基因，包括ＢＲＣＡ１及ＢＲＣＡ２。ＢＲＣＡ在ＤＮＡ修复的同源性重组（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）机制中扮演重要角色，ＢＲＣＡ基因突变会导致基因组不稳定性显著增加。胚系ＢＲＣＡ１／２突变（ｇＢＲＣＡｍ）将显著提高女性乳腺癌、卵巢癌以及其他癌症的发病风险。近年来的研究发现，在一小部分无胚系ＢＲＣＡ基因突变患者的乳腺癌或卵巢癌肿瘤组织中也可以检测到ＢＲＣＡ基因体细胞突变（ｓＢＲＣＡｍ）。ＢＲＣＡ基因也是与精准治疗密切相关的生物标志物，具有ＢＲＣＡ１／２突变的卵巢癌患者对铂类化疗非常敏感，预后良好，并可获益于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（ｐｏｌｙＡＤＰ⁃ｒｉｂｏｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＰＡＲＰ）抑制剂的治疗［１］。随着精准医学和靶向治疗的进展，对相关肿瘤患者血液和／或肿瘤组织进行ＢＲＣＡ突变检测将有助于更好地判断预后、选择靶向药物、选择化疗方案、在适当的条件下对家族遗传史患者亲属的患病风险进行评估，帮助医师根据患者的基因状态来选取更精准的治疗方案。

ＢＲＣＡ１／２基因序列较长，变异形式多样，变异位点分散遍布于２个基因的全长［２］，并且不是所有的ＢＲＣＡ变异都会损伤蛋白质功能，因而，变异的解读是ＢＲＣＡ检测中一个关键的环节。ＢＲＣＡ基因变异解读需要依据各类信息（包括来自群体数据库、疾病数据库、文献和患者病史的信息）进行综合评判。近年来国外多个权威机构先后发布了ＢＲＣＡ基因变异数据解读的标准或指南。目前，我国在ＢＲＣＡ基因变异数据解读领域尚缺乏规范性指导。因此，中华医学会病理学分会特组织分子病理学领域的相关专家进行了充分讨论，并形成共识发布，以指导与规范我国ＢＲＣＡ基因检测数据的解读，推动ＢＲＣＡ检测在我国的临床应用。

一、ＢＲＣＡ变异类型、检测区域及检测方法

ＢＲＣＡ变异类型主要包括点突变、小片段插入／缺失和大片段重排（ｌａｒｇｅｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）等。除ＢＲＣＡ基因编码区的变异外，内含子发生的一些变异亦可能会通过干扰ＲＮＡ剪切等方式影响蛋白质功能，因此ＢＲＣＡ检测必须同时覆盖编码区和相邻边界区（以±２０ｂｐ为佳）。

Ｓａｎｇｅｒ测序是检测ＢＲＣＡ基因点突变和小片段插入缺失的传统技术，也可以作为其他检测方法的补充或结果验证手段。多重连接依赖性探针扩增（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｌｉｇａｔｉｏｎ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｂｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙ，ＭＬＰＡ）、定量聚合酶链反应（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑＰＣＲ）和长片段聚合酶链反应（ｌｏｎｇｒａｎｇｅＰＣＲ，Ｌ⁃ＰＣＲ）是目前用于检测ＢＲＣＡ基因大片段重排的三个主要技术平台。

近年来，随着二代测序（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）技术的飞速发展，国内外越来越多的实验室已将ＮＧＳ技术应用于ＢＲＣＡ基因变异的临床检测。除应用于点突变和小片段插入缺失的检测外，在测序策略和生物信息学工具方面有着特殊设计的ＮＧＳ也可用于大片段重排的检测。

二、ＢＲＣＡ基因变异命名规则

推荐使用人类基因组变异协会（ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＶａｒｉａｔｉｏｎＳｏｃｉｅｔｙ，ＨＧＶＳ）命名法作为基因变异命名的主要指导原则以规范基因序列变异的命名。同时参考序列必须包含在内以确保基因变异命名的准确无误。ＨＧＶＳ命名法的首选ＤＮＡ编码参考序列是基因座参考基因组序列（ＬｏｃｕｓＲｅｆｅｒｅｎｃｅＧｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＲＧ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ􀆰 ｌｒｇ⁃ｓｅｑｕｅｎｃｅ􀆰 ｏｒｇ／），但ＬＲＧ尚未被广泛应用在解读的数据库和文献里。因此根据目前的情况，推荐使用最常用的２个转录本序列，分别为ＮＭ＿００７２９４􀆰 ３（ＢＲＣＡ１）和ＮＭ＿００００５９􀆰 ３（ＢＲＣＡ２），相应的蛋白质参考序列为ＮＰ＿００９２２５􀆰 １（ＢＲＣＡ１）和ＮＰ＿００００５０􀆰 ２（ＢＲＣＡ２）。同时推荐使用命名工具（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｕｔａｌｙｚｅｒ􀆰 ｎｌ）对基因变异的ＨＧＶＳ命名进行校验。

三、ＢＲＣＡ变异分类

根据国际癌症研究机构（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｇｅｎｃｙｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＣａｎｃｅｒ，ＩＡＲＣ）［３］、美国医学遗传学与基因组学学会（ＡｍｅｒｉｃａｎＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｉｃｓ，ＡＣＭＧ）［４⁃５］和胚系突变等位基因解读实证联盟（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ⁃ｂａｓｅｄＮｅｔｗｏｒｋｆｏｒｔｈｅＩｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｏｆＧｅｒｍｌｉｎｅＭｕｔａｎｔＡｌｌｅｌｅｓ，ＥＮＩＧＭＡ，ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎｉｇｍａｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ􀆰 ｏｒｇ／）［６］的分类系统，将ＢＲＣＡ基因变异按照风险程度由高至低分为以下５类：

致病性（５类，致病可能性＞０􀆰 ９９）、

可能致病性（４类，致病可能性在０􀆰 ９５～０􀆰 ９９之间）、

意义未明（３类，致病可能性在０􀆰 ０５～０􀆰 ９４９之间）、

可能良性（２类，致病可能性在０􀆰 ００１～０􀆰 ０４９之间）

良性（１类，致病可能性＜０􀆰 ００１）。

受试者的总体ＢＲＣＡ状况应为其所有ＢＲＣＡ１／２基因变异中风险程度最高的类别。

四、ＢＲＣＡ变异解读

目前，ＢＲＣＡ变异解读最权威的指南或标准包括：ＡＣＭＧ和美国分子病理学会（ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＡＭＰ）序列变异解读标准和指南（２０１５版）［４］，欧洲分子基因诊断质量联盟（ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓＱｕａｌｉｔｙＮｅｔｗｏｒｋ，ＥＭＱＮ）遗传性乳腺癌／卵巢癌分子遗传分析最佳实践指南（２００８版）［７］和ＥＮＩＧＭＡＢＲＣＡ１／２基因变异分类标准（１􀆰 １版）［６］。

ＡＣＭＧ于２０００年发布了第１版变异解读总体指南，并于２００７年进行了修订，２０１５年ＡＣＭＧ和ＡＭＰ联合发布了该变异解读指南的最新版本。ＥＭＱＮ是一家为全球实验室提供室间质量评估（ｅｘｔｅｒｎａｌｑｕａｌｉｔｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）服务的非营利性机构，致力于提高临床分子遗传学检测质量。１９９９年ＥＭＱＮ起草了第１版遗传性乳腺癌／卵巢癌分子遗传分析最佳实践指南，并于２００７年ＥＭＱＮ研讨会讨论，后在２００８年更新了该指南。ＥＮＩＧＭＡ是一个国际研究者联盟，致力于确定ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２和其他已知或可疑乳腺癌基因序列变异的临床意义。基于已发表的指南（包括ＡＣＭＧ２００７版）和各成员制定的分类标准，ＥＮＩＧＭＡ于２０１５年发布了专门针对ＢＲＣＡ１／２的变异分类标准。在其标准里，ＥＮＩＧＭＡ根据已知的对功能域的认知，总结了ＢＲＣＡ１／２的功能域以及可能恢复ＢＲＣＡ１／２基因功能的自然存在的框内ＲＮＡ异构体（ｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇｉｎ⁃ｆｒａｍｅＲＮＡｉｓｏｆｏｒｍｓ；表１）。

除此之外，ＥＮＩＧＭＡ还发表了一些针对临床意义未明变异的研究。这些都是变异解读非常有用的资源。同一变异依据不同的解读指南或标准所得到的解读结果可能会略有差异，因而我们建议在变异解读时具体指明所依据的指南或标准名称。

综合以上指南解读规则以及ＢＲＣＡ基因的特征，我们总结出以下解读规则：

１．致病性（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）⁃５类。包括以下几种情况：

（１）编码提前终止密码子的序列变异，即ＢＲＣＡ１第１８５５位氨基酸和ＢＲＣＡ２第３３０９位氨基酸前发生的无义突变或移码突变。

（２）发生在剪切位点即外显子上下游第一或第二个碱基的变异，但是，需除外经预测或已明确的可产生可能恢复ＢＲＣＡ１／２基因功能的自然存在的框内ＲＮＡ异构体的变异（表１）。

（３）拷贝数缺失变异，该变异导致ＢＲＣＡ１第１８５５位氨基酸和ＢＲＣＡ２第３３０９位氨基酸前发生移码突变，或者该变异移除１个或多个外显子且不是经预测或已明确的可产生可能恢复ＢＲＣＡ１／２基因功能的自发框内ＲＮＡ异构体的变异。

（４）任意大小的拷贝数重复变异，该变异导致１个或多个外显子重复并已被证实会导致ＢＲＣＡ１第１８５５位氨基酸和ＢＲＣＡ２第３３０９位氨基酸前发生移码突变。

（５）体外或体内功能研究显示对基因或基因产物有破坏作用且与肿瘤高危相关的其他类型变异。

２．可能致病性（ｌｉｋｅｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）⁃４类。

包括以下几种情况：

（１）该变异经ｍＲＮＡ水平的实验证实能够改变剪接，但是不会产生可能恢复基因功能的自然存在的框内ＲＮＡ异构体。

（２）该变异编码的氨基酸改变与之前定义的５类致病性错义突变相同，但发生改变的基础核苷酸不同，而且既往疾病关联并非由剪接事件所致，并且变异未见于作为对照的外显子组测序项目（ＥｘｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＰｒｏｊｅｃｔ）、千人基因组计划（１０００ＧｅｎｏｍｅｓＰｒｏｊｅｃｔ）或外显子组整合数据库（ＥｘｏｍｅＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ），或变异位于已确认的功能区。

（３）移除密码子的小片段框内缺失变异，该变异涉及的氨基酸位点已被证实可发生错义替换５类变异，且既往疾病关联并非由于剪接事件所致，并且变异未见于作为对照的外显子组测序项目、千人基因组计划或外显子组整合数据库，或变异位于已确认的功能区。

（４）体外或体内功能性研究显示对基因或基因产物有破坏作用的其他类型变异，并且变异未见于作为对照的外显子组测序项目、千人基因组计划或外显子组整合数据库，或者变异位于已确认的功能区。

３．意义未明（ｕｎｃｅｒｔａｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）⁃３类：证据不足以将其归类为１、２、４或５类的变异，或证据与良性和致病性分类相矛盾的变异。

４．可能良性（ｌｉｋｅｌｙｂｅｎｉｇｎ）⁃２类。包括以下几种情况：

（１）该变异编码的氨基酸改变与已确认的１类良性变异相同，但发生改变的基础核苷酸不同，且无证据表明该变异会导致剪接事件。

（２）个体发生的胚系变异与已知致病变异在同一基因上呈反式（ｉｎｔｒａｎｓ）排列，且该个体除了ＢＲＣＡ相关肿瘤外无明显其他临床表征。

５．良性（ｂｅｎｉｇｎ）⁃１类：

（１）外显子组测序项目、千人基因组计划或外显子组整合数据库中等位基因频率＞５％的变异。

（２）体外或体内功能研究显示对蛋白质功能或剪接无破坏作用的变异。

五、ＢＲＣＡ变异解读数据库

变异解读的关键步骤之一是收集证据，并基于这些证据对变异进行分类。数据库是挖掘这些证据的重要资源。表２列出了一些常用的数据库，依使用情况分为２类：群体数据库和ＢＲＣＡ相关数据库。群体数据库记录的是以种群为基础的研究中发现的变异。大群体中的变异频率可从此类数据库中获取。ＢＲＣＡ１／２变异相关研究已开展多年，有一些专门收集ＢＲＣＡ变异的数据库和积累大量ＢＲＣＡ变异的疾病数据库，可从中找到变异解读和相应的支持证据。

六、ＢＲＣＡ检测报告

一份完整的ＢＲＣＡ检测报告要能够被肿瘤科医师或其他非分子病理学专业的医师理解，报告内容应至少包括以下部分：样本信息、检测结果、基因变异分类的详细解释、检测方法和覆盖区域、签名和联系信息。样本信息部分应包括患者基本信息、样本类型、临床诊断、家族史。若送检的是肿瘤组织，样本信息部分还应该包括病理诊断、肿瘤细胞含量、取材时间、样本处理方式等信息［１０］。检测结果部分应列出在该被检测者中发现的所有２～５类基因变异和总体ＢＲＣＡ状态。基因变异分类的详细解释部分应提供基因变异分类证据的简要说明。检测方法和覆盖区域部分应明确描述使用的是何种ＢＲＣＡ检测方法以及该方法覆盖的指定序列区域。签名和联系信息部分应列出实验操作、数据分析与报告撰写、报告复核的人员姓名及便于进一步问询的联系信息。数据分析人员应具有临床医学、分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训。最终报告应由中级或硕士以上具有相关背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人（高级职称或医学博士学位）审核。检测报告模板如表３。