肿瘤粪菌疗法

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人类肠道含有丰富的细菌，其数量是人体细胞数量的10倍，从上往下细菌越来越多：十二指肠102~103/ml，空肠103~105/ml，回肠105~107/ml，大肠 1010~1012/ml。肠道菌群（gut microbiota）的重量约占人体体重的2磅左右，其基因量约3百万个基因，是人体基因量的100倍。肠道菌群的细菌组成，在门级（phylum level）水平上，厚壁菌门（Firmicutes）及拟杆菌门（Bacteriodetes）约占90%，其余为蓝藻细菌（Cyanobacteria），变形菌门（Proteobacteria），放线菌（Actinobacteria），梭菌属（Fusobacteria）及疣微菌门（Verrumicrobioa phyla）。经过5亿年的进化，这些微生物与宿主已经形成了一个命运共同体，成为宿主的另外一个重要器官，这些共生菌群（commensal microbiota）通过生物活性分子与宿主交流，影响宿主的多种免疫及非免疫功能[1]，见图1。
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1 肠道菌群调控免疫反应
生命早年的微生物暴露对动物日后有长期的影响，免疫系统的充分发育有赖于出生后共生菌群的暴露与接触，肠道相关性淋巴组织（gut-associ-ated lymphoid tissues, GALTs）完全成熟、产IgA浆细胞和激活T细胞募集到黏膜，均有赖于出生后菌群驱动信号对上皮细胞及树突状细胞（dendritic cells, DCs）的作用。延迟细菌暴露的无菌（germ-free, GF）小鼠，炎症性肠病（in?ammatory bowel disease, IBD）及过敏性哮喘死亡率更高[2]。
定植在肠道黏膜上皮表面的菌群可以直接作用于宿主或者通过产物如蛋白质、脂质、碳水化合物及核酸间接作用于宿主，调节局部炎症及免疫。宿主与肠道菌群的生理性相互作用可以直接抵御共生菌如小肠乳酸杆菌（Lactobacilli）和变形菌（Proteobacteria）、结肠梭状芽胞杆菌（Clostridia）和拟杆菌（Bacteroides），避免病原菌如沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏杆菌（Shigella spp.）感染，控制内源性病理生物（pathobionts）如艰难梭菌（Clostridium diffcile）和肠球菌（Enterococci）的过度繁殖[3]。
共生菌群不仅调节肠道局部免疫，而且调节全身先天性免疫及获得（后天）性免疫。皮肤、阴道、口腔等屏障表面的菌群通常只对局部免疫负责，但是，肠道菌群则具有全身性免疫自稳作用，其机制可能与肠道菌群种类繁多、数量巨大、肠道黏膜面积广阔有关[4]。肠道缺乏共生菌群的小鼠，炎症反应及免疫应答能力下降，对各种刺激不能形成理想的防御反应，不能有效抵抗多个解剖部位的感染，如肺甲型H1N1流感、口腔李斯特菌感染，而且难以诱导自身免疫性疾病动物模型如多发性硬化、关节炎，甚至对多种抗肿瘤免疫治疗及化疗不敏感[5]。观察发现[6] ：GF 小鼠、抗生素治疗小鼠多个亚群的T细胞如Th1、Th17（二者分别产生IFN-γ和IL-17）数量下降，Treg细胞数量增加，全身感染不能激发这些小鼠的先天性和后天性免疫反应，见图2。
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以前人们一直认为 ：肠道菌群对人体免疫成熟的刺激作用依赖整个菌群的共同作用。现在发现，肠道的单个细菌即可以刺激免疫应答。分节丝状菌（segmented flamentous bacteria, SFB）是一种不可培养的细菌，可以刺激小鼠黏膜免疫应答的成熟。缺乏 SFB，小鼠 IgA 滴度下降、黏膜Th1及Th17细胞水平降低，对肠道致病菌Citrobacter rodentium、Salmonella spp.的反应不良[7]。
Bacteroides fragilis通过调节TLR2激动剂—囊多糖（capsular polysaccharide）A驱动产IL-10 Treg细胞的分化，保护小鼠免受肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus）感染以及三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS）诱导的结肠炎。
2 肠道菌群调节能量代谢
人体将多余能量储存为脂肪以调节人体能量平衡，肠道菌群参与了这一过程[8]。实验显示：尽管GF小鼠比普通小鼠每天多吃30%的食物，但是GF小鼠的总体脂比普通小鼠少40%。把细菌定植入GF小鼠肠道内，将GF鼠变为有菌鼠（转化鼠，下同），小鼠每天摄食量尽管有明显减少，但是在两周内小鼠体重却明显增加，体内脂肪增加60%，并且发生胰岛素抵抗[9]。这种体重的增加显然是由于肠道菌群将宿主摄入的不消化多糖如抗性淀粉、寡聚糖、菊粉进行发酵降解，肠道葡萄糖摄取增加所致，见图3。
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肠道菌群与肥胖的关系首先在啮齿动物模型上得到证实。Ley RE等[10]观察了遗传性肥胖 ob/ob小鼠和对应瘦鼠的5000多个肠道菌群16S RNA基因序列，发现ob/ob肥鼠的拟杆菌门减少50%，硬壁菌门有同样比例的增加。人类研究中观察12名肥胖受试者发现，与消瘦受试者比较，饮食干预前肥胖受试者肠道拟杆菌门较低（减少90%），硬壁菌门较高（增多20%），经过52周限制饮食之后，受试者体重下降，肠道拟杆菌门/硬壁菌门比例接近瘦人。 Turnbaugh PJ等[11]分别将ob/ob肥鼠及瘦鼠回肠细菌移植到野生型GF肠道，与移植瘦鼠肠道菌群的GF小鼠相比，2周后移植肥鼠肠道菌群的GF鼠其体脂含量有中等增加，从食物中摄取能量更多。说明肠道菌群相关性机制在饮食相关性代谢紊乱、肥胖的发生发展过程中扮演重要角色，提示肠道菌群参与宿主代谢性疾病的发生[12]。
3 共生菌群及菌群失调在肿瘤发生中的作用
生理条件下，肠道微生物群不仅不是致癌因素，反而是抗癌因素。肠道菌群具有时间稳定性
和回弹性，遇到损伤可以自己修复[13]。但是如果肠道菌群组成的变化超过了其回弹能力，则会引起菌群失调（dysbiosis）。菌群失调导致病原微生物控制失败、炎症或免疫反应失调，引起急性或慢性组织损伤。
肠道屏障功能破坏后的肠道菌群失调本身及其与造血细胞的相互作用调节炎症反应，成为肿瘤的发病原因。 IL-18具有黏膜保护作用。缺IL-18、IL-18R、MyD88、炎症组（in?ammasomes）及炎症组信号分子的小鼠，不能产生IL-18、不能处理（process）IL-18、对IL-18也不能反应，这些小鼠的肠道菌群失调，Bacteroidetes（Prevotellaceae）及TM7比例升高，化学成瘤敏感[16]。将这些小鼠与健康小鼠共居（cohousing），或者将它们的粪便移植给健康小鼠，健康小鼠容易发生结肠癌[14]。
一些特定的细菌如Streptococcus gallolyticus，Enterococcus faecalis, enterotoxigenic B. Fragilis, enteropathogenic Escherichia coli及Fusobacterium spp 可以诱导结肠癌[15]。结肠癌荷瘤小鼠， Odoribacter和Akkermansia基因富集。一些粪菌如Methanobacteriales与结肠癌的发生密切相关，Fusobacterium nucleatum通过促进FadA与E-cadherin的粘合，激活β-catenin/Wnt信号，诱导促癌髓系细胞的增殖与活化。上述细菌不仅可以致癌，还可以通过多种机制如细菌群体感应（quorum sensing）的信息交流、激素及抗菌因子的分泌，共同作用改变肠道菌群的组成，引起菌群失调[15]。研究发现：与周围正常组织相比，肠道息肉对细菌得通透性更高、更容易发生细菌移位。这些移位的细菌通过诱导促癌细胞因子IL-6、IL-11、IL-23、IL-17、IL-22的产生，诱导炎症反应，促进息肉进展[16]。
肠道菌群中的一些细菌不仅具有局部致癌作用，还可以诱导远隔部位的肿瘤。结肠H. hepaticus感染不仅可以升高APCmin/+小鼠、氧化偶氮甲烷处理Rag2?/? 小鼠的小肠及结肠的肿瘤发生率，而且升高了APCmin/+/Rag2?/?小鼠的乳腺癌及前列腺癌的发病率，还提高了小鼠肝脏对化学致癌物、病毒致癌的敏感性[17]。肠道菌群诱导远隔部位肿瘤的机制还不清楚，可能部分与调节 TNF依赖的全身炎症反应张力（systemic in?ammatory tone）、氧化应激、白细胞及上皮细胞的基因毒性（genotoxicity）有关。菌群失调及抗生素治疗可以改变肠道菌群对雌激素的代谢能力，该能力被认为是肠道菌群调节远隔部位肿瘤的机制之一[18]。另一方面，肠道菌群也具有抗肿瘤作用。肠道菌群在结肠发酵膳食纤维、产生短链脂肪酸（short chain fatty acids, SCFAs） ， 后者通过①激活G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors, GPR）109a，诱导肠道上皮细胞分泌IL-18；②直接作用于DC、巨噬细胞及T细胞；③诱导Treg细胞增殖，直接调节Treg细胞池的大小和功能，产生抗炎细胞因子IL-10，从而抑制结肠炎症反应、抑制肿瘤形成[19] 。IL-18通过调节IL-22的产生和作用，促进肠道黏膜的修复。IL-22由肠道黏膜固有层的初始淋巴细胞产生、通过激活STAT3，诱导上皮细胞增殖并产生抗菌肽，因此发挥抑癌形成作用。遗传性缺乏Tlr5、Il10、Tbx1、Rag2等免疫相关物质的小鼠，由于肠道菌群失调，更容易发生结肠炎及结肠癌，这种特性并且可以传递给健康小鼠。

4 肠道菌群在肿瘤治疗中作用
肠道菌群有益于某些肿瘤治疗，在肿瘤本身或其并发症的治疗中发挥重要作用。研究发现：
肠道菌群通过调节肿瘤微环境中不同髓系细胞的功能，影响肿瘤免疫治疗及化疗的反应。瘤内注射 CpG 寡核苷酸（oligonucleotides, ODN）免疫治疗、联合IL-10信号抗体中和治疗可以有效治疗普通小鼠的皮下接种肿瘤，但是对GF小鼠、抗生素治疗小鼠无效[20]。对普通小鼠，该疗法可以在数小时内引起TNF依赖性肿瘤严重出血坏死，该出血坏死依赖肿瘤相关性初始髓系细胞产生TNF及NO，继而CD40介导DC激活、IL-12分泌、CD8+T介导的肿瘤特异性过继免疫，发挥持续的肿瘤杀灭作用。但是，在肠道菌群缺乏小鼠，CpG-ODN治疗后，肿瘤浸润髓系细胞产生炎症细胞因子如TNF、IL-12的能力明显削弱。口服灌注LPS 可以部分恢复抗生素治疗小鼠对CpG-ODN治疗的反应不良。遗传性LPS受体编码基因、 TLR4编码基因缺乏小鼠，对CpG-ODN的反应要比野生型小鼠低。提示：肠道菌群LPS通过TLR4受体可以直接或间接激活肿瘤浸润髓系细胞对TLR9配体CpG-ODN的反应。肠道菌群组成不同，CpGOGN治疗后TNF的反应高低不同。肠道菌群中某些G+和G-的多少与肿瘤髓系细胞对CpG-ODN反应呈正相关，而共生乳杆菌数量则与肿瘤髓系细胞对 CpG-ODN反应呈负相关。G-Alistipes shaii 可以增强CpG-ODN的反应，而乳杆菌L. fermentum则相反削弱CpG-ODN的反应[20]。
铂类化合物如草酸铂、顺铂的治疗效果也与肠道菌群密切相关[20]。皮下移植同样的肿瘤，抗生素治疗小鼠、GF小鼠对铂类化合物如草酸铂、顺铂的反应显著低于普通小鼠。抗生素治疗①抑制草酸铂诱导的炎症相关基因、单核细胞分化、激活和功能相关基因的上调表达；②防止草酸铂诱导的正常细胞功能如代谢、转录、翻译及DNA复制相关基因的下调表达；③抑制肿瘤浸润髓系细胞通过NADPH氧化酶NOX2的ROS产量，从而削弱铂类化合物的抗肿瘤效果。与CpG-ODN免疫治疗不同，草酸铂的治疗效果不受TNF或TLR4影响。
细胞特异毒性CD8+T细胞的过继输注治疗同样与肠道菌群有关。全身照射（total body irradiation, TBI）治疗可以提高CD8+T细胞过继免疫治疗的效果，有益于激活DC，有益于内环境稳定细胞因子的产生。TBI促进的肠系膜淋巴结细菌移位、升高了血浆LPS水平。抗生素治疗、多黏菌素B中和血浆LPS、阻断LPS信号传导都可以削弱TBI及CD8+T细胞过继免疫治疗的效果。给未照射小鼠输注LPS，可以增加过继输注CD8+T细胞的数量，增强其功能，带来肿瘤的长期治愈[21]。与草酸铂类似，环磷酰胺（cyclophosphamide, CTX）除直接细胞毒性外，还诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death），进而引出自适
应抗肿瘤免疫反应（adaptive antitumor immune response），同时产生肿瘤特异性CTLs。CTX 杀伤肿瘤、诱导免疫反应的作用依赖于肠道菌群，GF小鼠或抗生素治疗小鼠对CTX不敏感。对普通小鼠，CTX治疗改变了肠道菌群的组成，诱发黏膜炎及引流淋巴结的G+细菌移位，增强效应Th17细胞及记忆Th1细胞免疫反应[22]。化疗药物引起的免疫原性细胞死亡激活 APCs、诱导抗肿瘤免疫反应，这个作用不仅与坏死组织释放的炎症介质有关，还与肠道菌群及其产物的预激或增强有关，见图4。
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综上所述，我们可以清楚地看到，肠道菌群可以在多个环节上影响肿瘤的发生、发展与治疗。
鉴于肠道菌群在肿瘤发生、发展及治疗中的重要作用，我们有理由相信：不久的将来，粪菌移植将会被用于肿瘤治疗，从而产生一个崭新的肿瘤治疗方法—肿瘤粪菌疗法（cancer?fecal?microbiota?therapy, CFMT）。CFMT从技术上已经完全成熟，基本思路有二：①对肿瘤患者的肠道菌群进行化学和（或）物理清除后，将健康供者的粪菌或者人工改造的粪菌移植给肿瘤患者；②将肿瘤患者粪菌取出后，在体外进行人工改造，然后回输给肿瘤患者。但是，实际应用方面仍然有很远的路要走。肠道菌群与肿瘤的关系是近年来肿瘤研究的一个热点领域。高通量微生物超变16S核糖体RNA基因测序及生物信息学算法（bioinformatic algorithms）的使用，使研究人员可以集群分析某肠道微生物群在肿瘤及内环境稳定中的综合作用，而无需进行单个分离及培养分析。技术的创新使研究人员很容易分辨出致癌细菌（如 Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Bacteroides fragilis）和抗癌细菌 [如Eubacterium, Lactobacillus, Bacteriodes, Clostridium（XIVa and IVa）, Faecalibacterium, Bifdobacterium, Roseburia]，很容易了解肿瘤患者肠道菌群的微生物模式（microbial profle），进而针对性人工改造肠道菌群，从而为肿瘤预防、肿瘤治疗提供了可能。