基因检测质控的那点事儿（一）——样本质量是关键

作者：闵

基因检测在目前的肿瘤治疗，尤其是非小细胞肺癌治疗中占据了十分重要的地位，越来越多的病友也开始追求基因检测结果的准确性和可靠性，会了解各家公司宣传的检测套餐的技术参数等等，试图找出最靠谱的公司。

几乎所有人的关注点都在技术、设备等等软硬件方面，却都忽略了一个最基本但却最重要的问题——样本质量，这才是检测成功的基础，而样本质控则是把控这点的关键。本篇就简单的聊一聊基因检测质控的那些事。

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样本与基因检测的关系

很多病友对于基因检测的理解有误，认为是基因检测决定了自身的基因结果，所以对于检测技术、检测设备等等格外看中。

但实际上基因检测只是一种检查手段，检查对象则是各位提供的样本（组织样本或体液样本），更确切一点应该是样本中的肿瘤细胞及肿瘤DNA。基因是否发生突变是自身肿瘤细胞已经决定的，基因检测只是通过PCR、NGS等等技术手段去发现和确认。

为什么一定要求样本里含有肿瘤细胞呢？答案很简单，因为我们做基因检测就是为了知道病人肿瘤细胞是否携带驱动基因突变，是否能使用靶向药针对治疗，那要是样本里没有肿瘤细胞，我们做检测还有什么意义？

就好比淘金，淘到的金属是金是铜不是人为决定的，而是天生的，我们只是通过检查手段区分哪些是金子哪些是铜粒，那么假如这一网兜捞上来的全是沙子、连金属都没有，再先进的检查设备也变不出金子来。

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样本质量如何评估

NGS二代测序技术因其高通量、覆盖多种突变类型的特点，成为目前临床使用最为广泛的基因检测技术。影响二代测序检测结果的因素众多，其中最为重要的就是样本质量。

NGS的样本质量评估方式有两种：1、病理评估，直接通过HE染色等在显微镜下观察是否有肿瘤细胞；2、DNA提取质量评估，主要评估样本中提取到的DNA的总量及片段分布。

关于病理评估应该不用多做介绍，指的就是病理诊断，这也是保证检测有效的最重要的保险——直观评估样本中是否取到肿瘤细胞以及肿瘤细胞含量如何。

通常来说基因检测的病理评估要求是组织样本中肿瘤细胞含量达到30%、20%以上，这个标准包含了两点要求：1、样本中有肿瘤细胞；2、肿瘤细胞占比要达到一定比例。病理诊断完美解决以上两点要求，达到病理评估标准的样本用于基因检测基本都有很高的成功率和可靠性。

病理评估需要有专业的病理医生，一般在医院病理科做，部分基因检测公司也有自己专业的病理团队可以评估，没有专业病理医生的检测公司通常会省略这一步，以DNA提取质量代替。

DNA提取质量指的是从样本中提取到的DNA总量及片段分布是否达到上机实验的要求，具体如下：蜡块样本（FFPE）DNA总量要求≥250ng，片段分布≥1000bp；外周血样本（cfDNA）总量要求≥30ng，片段分布≥140-180bp。

DNA总量代表的意义很好理解，就是“有没有”和“够不够”；片段分布较难理解，我曾将基因比作高铁，而DNA可以看成是很多辆高铁彼此相连，bp就是测量高铁长度的单位，片段越长就是高铁越长说明DNA信息越完整，反之则更碎片化，不同的样本提取到的DNA碎片化程度不一样，简单来说碎片化过于严重就难以获取有效信息了。

DNA提取质量（指品质，非重量）也很重要，但更像是一个技术标准，满足条件的DNA才能正常上机进行NGS测序。由于提取出来的DNA全部溶于提取液中，无法人为再分辨其中是否含有肿瘤DNA以及其占比多少，若没有肿瘤DNA或含量极低则检测仍可能漏检甚至无意义，因此更体现出病理评估的重要性。

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不同样本类型的区别

常用的基因检测样本有很多种，比如手术样本、穿刺样本、气管镜样本、新鲜组织、胸水样本、血液样本以及脑脊液样本，前四种统称组织样本，而后三种则成为体液样本。

组织样本：

手术样本、穿刺样本和气管镜样本都已制备成蜡块，因此都可以进行病理评估，满足要求后即可提取DNA，病理评估合格的样本提取的DNA样本用于检测基本都不会有太大问题。

新鲜组织虽然也属于组织样本，但未经历制备蜡块和病理评估环节，直接送到基因检测公司，若公司为图方便也跳过病理评估环节，则同样可能出现不含有肿瘤组织，却仍用于检测导致漏检假阴性的情况。

遗憾的是从病人的角度只能看到检测结果，却难以分辨阴性的结果是自身确实无突变导致，还是新鲜组织里没有肿瘤细胞导致的假象，从而难以下决定要不要重新检测。若是前者，那就是又浪费一次金钱与时间；若是后者，也并不代表重新做一定有突变，只是重新用合格的样本再验证结果而已。

体液样本：

血液是最常用的体液样本，其内除了各种血细胞外，还会含有循环肿瘤细胞（CTC）以及循环肿瘤DNA（ctDNA），这两者就是血液基因检测的理论基础。由于血液中还有其他成分，因此如同组织样本一样，病人的血液提取得到的总DNA中除一小部分肿瘤DNA外，还有很多来自正常细胞的DNA。

血液样本无法做病理评估，因此只能跳过第一阶段，直接提取DNA，然而即便提取DNA质量符合要求，也难以保证其中有足够浓度的肿瘤DNA，这也是造成血液可能存在假阴性的主要原因。

胸水与脑脊液样本平常接触机会不多，在某些情况下也是可选择的检测样本，两者有共同点，也有区别。先说胸水样本，胸水样本在体液样本中有一个非常大的优势就是“量足够多”，放一次胸水基本都要几百甚至上千毫升，体量远超其他体液样本，这个特点也让它有了两种不同的检测方式。

第一种是离心取沉淀，胸水样本可以先离心后收集细胞残渣等沉淀做成蜡块，然后在显微镜下观察行类似病理诊断的操作，确认是否含有肿瘤细胞，若含有肿瘤细胞则可考虑用胸水蜡块按照组织样本进行检测（若蜡块剩余不足，建议重新抽取胸水），若无肿瘤细胞则不考虑以上操作。

出现这种情况就要介绍胸水样本的第二种检测方式——取上清检测，也许有的病友会疑惑胸水沉淀中没有癌细胞，取胸水上清检测是啥意思？没错，这就是一个退而求其次的办法，因为ctDNA（循环肿瘤DNA）可能存在于胸水中，就如同其会存在于血液中一样，所以用胸水上清检测从某种程度上来说相当于在用血液检测，同时也意味着跳过病理评估，只评估DNA提取质量是否满足上机要求，并不能保证一定含有肿瘤DNA。不同之处在于一般血液检测只抽10ml毫升血液，而胸水上清至少都有几百毫升，量多了之后也增加了检测成功的机会。

脑脊液样本与胸水类似，也可以送检做细胞学病理，但不同于胸水的量大，脑脊液一次抽取量控制在5ml毫升左右较为合适，由于抽取量少，通常只能在做细胞病理与直接送基因检测两者之间选择一种。

好在脑脊液做基因检测的方式只用一种，即类似血液及胸水上清一样直接提取，不离心取沉淀，因此无论脑脊液病理是否有癌细胞，所采取的检测方式是一样的，但先明确脑脊液病理有癌细胞让检测结果可靠性更高。

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总结

样本问题反复提及，但从来没有以样本质量的角度分析其与检测结果的关系，本文分为组织样本与体液样本两大类，分析组织样本优先级更高的原因以及体液样本易出现假阴性的原因。

本文的原意并不是说做基因检测必须有突变，而是在于检测结果是否可靠的基础在于样本。病理评估合格，则做出来的结果才更可信，有就是有，无就是无，不会有太多争议。用不合格的样本，或者未经评估的样本做检测，有突变最好，没有突变则会让问题复杂，因为无法分辨病人是真的没有突变，还是样本不合格导致的漏检。

归根结底在于样本中所含肿瘤细胞或DNA的多少决定了检测成功的基础，只有病理诊断可以提前评估，这也是组织样本天然的优势，而体液样本中胸水与脑脊液也可以做细胞病理，唯独血液不能做病理，因此更容易出现假阴性。

从确保检测成功率的角度来说，样本选择的优先顺序为：手术样本＞穿刺/气管镜样本＞胸水样本＞血液/脑脊液（其余稳定，仅脑转进展的病人优先考虑脑脊液，不推荐血液）。

需要注意的是，文中介绍是从理想角度出发，在能够取到样本的情况下如何选择最佳样本，如何确保检测结果可信度最高，但实际中也会遇到完全无法获取组织样本的情况，此时则不能死板坚持用组织样本检测，酌情选合适的体液样本替代。

在下周的文章中，将用实例进一步解析样本质控的重要性，敬请期待。

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