联合治疗相互拮抗而耐药
Oncotarget. 2016 May 17; 7(20): 29187–29198.Published online 2016 Apr 11. doi:10.18632/oncotarget.8692
PMCID: PMC5045388
Acquired resistance to combination treatment through loss of synergy with MEK and PI3K inhibitors in colorectal cancer
标题：结直肠癌因协同丧失导致MEK和PI3K抑制剂联合治疗耐药
（本文意义在于联合治疗的耐药不一定是信号通路改变，也有可能是联合药物之间存在拮抗关系，不要从单药角度看待联合治疗的耐药，联合药物不一定协同增效，也可能效果更差。）
摘要:
从历史上来看，对联合治疗的获得耐药(AQR)的理解是基于对其参与联合的药物耐药性的认识。为了测试药物相互作用是否能成为药物联合治疗耐药的一个额外因素，并生成了联合和单药MEK和PI3K抑制剂治疗的AQR模型。联合指标表明，PI3K和MEK抑制剂的联合治疗仍然对细胞单药治疗AQR具有协同效果，而不是联合治疗的AQR细胞。在细胞表型、通路信号和药物交叉耐药的模型之间也存在差异。基因组学显示TGFB2-EDN1过度表达在联合治疗AQR模型中成为主要候选因素。在亲代细胞中补充内皮素，将协同性转化为相互拮抗。在AQR细胞沉默TGFB2或EDN1，PI3K和MEK抑制剂之间产生了协同作用。这些结果突出表明，联合治疗中AQR可以通过对单药的可选机制而进展，包括药物相互作用的改变。
引言:
联合治疗，使用两种或多种药物联合治疗，已成为优化治疗效果的常用策略，并减少毒性和耐药性。该策略基于这样原则，即通过联合药物产生超过单药的额外效果。这些影响可以是协同的、增加的或拮抗的，即大于，等于，或者更差分别与添加药物增加效果相比。
耐药仍然是治疗失败的主要原因。耐药性可能是由于内在因素显示缺乏最初的药物活性。由于药物治疗的选择压力所引起的变化，耐药也可能是获得性, 因变化进展。已经确定了许多获得性耐药机制(AQR)，包括药物流出的改变，代谢和解毒，获得性DNA突变，基因扩增，通路冗余，串扰和反馈，以及耐药子克隆。
近年来，分子靶向治疗的出现使人们越来越多地将联合治疗作为一种规避药物耐药性的手段。然而，对于联合治疗的AQR仍然是可以预期的，很容易从临床得到证据。目前尚不清楚的是，联合治疗的AQR机制是否与单药治疗相同，药物相互作用的改变是否也可能是一个因素。
在本研究中，对MEK和PI3K抑制剂显眼联合AQR模型，与单药治疗的AQR模型同时生成。在联合治疗的细胞中观察到联合治疗AQR的选择性损失，而不是单药治疗，在联合治疗的应用中，出现失去协同作为一种新型的AQR机制。
结果:
AQR生成和协同丢失
KRAS G13D突变 HCT116细胞和PIK3CA H1047R突变(cancer.sanger.ac.uk)培养在各自IC50浓度AZD6244(MEK抑制剂)和BKM120(PI3K抑制剂)里, AZD6244单独(IC50浓度 2次治疗),BKM120单独(IC50浓度 2次治疗),或拟似物(2次治疗 0.25% DMSO)。所有模型都提供了两种治疗方法，以最大程度地减少细胞治疗的偏差。经过长时间的治疗后，培养在AZD6244和BKM120的HCT116细胞开始对AZD6244和BKM120治疗(被指定为HCT116CR细胞)的联合治疗产生耐药性(表1)，与使用DMSO(HCT116DM细胞)培养的HCT116细胞相比，联合指数(CI)分析表明，在HCT116CR细胞中，AZD6244和BKM120是拮抗的，而它们在HCT116DM细胞中具有协同作用。HCT116CR细胞也显示出对AZD6244单药的耐药性增加，但不是BKM120。
表1：IC50 和多种药物单独和联合治疗HCT116衍生细胞的指数值
Cell Line细胞系 HCT116DM HCT116AR HCT116BR HCT116CR
AZD6244 IC50 (μM) 2.8 ± 0.03 30.2 ± 0.12*
10.2 ± 0.20*
6.1 ± 0.31*
BKM120 IC50 (μM) 1.3 ± 0.01 4.8 ± 0.04*
5.2 ± 0.19*
1.2 ± 0.02
AZD6244 + BKM120 IC50 (μM) 0.8 ± 0.02 0.9 ± 0.04 0.9 ± 0.02 10 ± 2.34*
AZD6244 + BKM120 CIfu0.5 0.15 ± 0.031 0.29 ± 0.028 0.21 ± 0.007 1.98 ± 0.210*
GDC0973 IC50 (μM) 5.7 ± 0.81 20.3 ± 2.32*
22.1 ± 1.94*
17.8 ± 1.66*
BYL719 IC50 (μM) 9.8 ± 1.20 30.2 ± 3.11*
38.2 ± 4.04*
25.6 ± 2.85*
GDC0973 + BYL719 IC50 (μM) 0.5 ± 0.05 0.5 ± 0.02 0.6 ± 0.05 10.9 ± 1.81*
GDC0973 + BYL719 CIfu0.5 0.16 ± 0.083 0.28 ± 0.042 0.39 ± 0.012 1.96 ± 0.381*
IC50 值：AZD6244, BKM120, GDC0973, and BYL719单药和联合。CI值：IC50 (fu0.5) 未受影响小部分。 Additivity = 1, Antagonism > 1, Synergy < 1.
*p < 0.05 IC50 值与 HCT116DM的偏差。
HCT116细胞使用AZD6244(HCT116AR细胞) 单独治疗和BKM120(HCT116BR细胞)单独治疗显示对2种药物的AQR。交叉耐药在HCT116AR细胞使用BKM120治疗观察到,以及HCT116BR细胞使用AZD6244治疗。尽管如此,联合AZD6244和BKM120仍对HCT116AR和HCT116BR细胞起协同作用。
为了确认AQR和丢失协同不是复合特定的,对GDC0973(MEK抑制剂)和BYL719(PI3K抑制剂) 治疗敏感性进行了评估。AQR类似的模式,交叉耐药和丢失协同作用在各自的细胞中观察到(表1)。此模式唯一不同是增加HCT116CR细胞对BYL719耐药。
为确认观察并不特定于HCT116细胞, LoVo (KRAS G13D突变,cancer.sanger.ac.uk)结直肠癌细胞AZD6244 (LoVoAR)BKM120(LoVoBR)及其联合(LoVoCR) 的AQR使用同样的方法用于生成HCT116细胞。细胞表现出相似的AZD6244和BKM120治疗耐药模式,以及GCD0973和BYL719治疗, 如在HCT116细胞观察到。
通路信号和抑制
对基线p-erk、p-akt、p-s6和p-4ebp1的分析表明HCT116AR细胞比HCT116DM细胞更高的p-erk，与先前的报告相一致。HCT116BR细胞升高了p-erk和p-akt。HCT116CR细胞也增加了p-erk和p-akt，但也减少了p-4ebp1。
联合治疗后，p-erk、p-akt、p-s6和p-4ebp1在所有细胞中均减少，表明通路抑制活性被保留。AZD6244治疗也减少了所有细胞中的p-erk，BKM120治疗减少了所有细胞中p-akt，这表明单药的抑制活性也被保留了下来。BKM120也降低了HCT116CR和HCT116AR的p-4ebp1，但不是HCT116BR细胞，表明HCT116BR细胞对PI3K抑制的AQR可能涉及减少p-4ebp1抑制。AZD6244也明显降低了p-akt和p-4ebp1(在统计学上没有显著意义; p=0。06)在HCT116CR，但不是其他的细胞。
细胞表型分析
与它们已知的活性一致，单药AZD6244和BKM120治疗导致了G1期细胞的增加，联合治疗导致了在HCT116DM细胞中增加亚G1种群和细胞凋亡。在HCT116AR和HCT116BR细胞中，没有观察到单药治疗后G1期细胞的增加。然而，联合治疗仍然导致了这些细胞中G1子组细胞的增加和细胞凋亡。在HCT116CR细胞中，G1或子G1的数量没有显著增加，也没有在单药和联合治疗后的细胞凋亡。实际上，与HCT116DM细胞相比，在HCT116CR细胞中，联合治疗后的细胞凋亡显著减少。在伤口愈合试验中，HCT116AR、HCT116BR和HCT116CR细胞在使用DMSO治疗时，与HCT116DM细胞相比，增加了细胞迁移。联合治疗导致HCT116DM、HCT116AR和HCT116BR细胞迁移的减少，但HCT116CR细胞没有。
药物交叉耐药性分析
HCT116衍生细胞对5-氟尿嘧啶、卡铂和索拉非尼的敏感性没有发现明细差异，这表明一种多药耐药性表型并不对耐药负责。与早期的观察结果一致，HCT116AR、HCT116BR和HCT116CR细胞比HCT116DM细胞对MEK和PI3K抑制剂更具有耐药性。有趣的是，HCT116CR细胞也表现出对Akt和mTOR抑制剂的敏感性。HCT116BR细胞与HCT116CR细胞一样对Akt抑制剂的敏感。HCT116AR细胞对mTOR抑制剂更耐药。
体内评估
HCT116CR和HCT116DM细胞被植入了雄性免疫缺陷小鼠体内。当肿瘤的大小达到约130-150 mm3时，治疗就开始了，包括拟似物治疗或AZD6244(25毫克/公斤)和BKM120(40毫克/公斤)联合治疗。经过10天的治疗后，拟似物治疗的小鼠肿瘤达到了最大的肿瘤体积。与体外观察到的治疗协同作用一致，与拟似物治疗相比，HCT116DM肿瘤生长被治疗显著抑制。与在体外观察的AQR一致，联合治疗在HCT116CR中减少肿瘤生长的速度比HCT116DM肿瘤少，但两者的差异在统计学上并不显著。在治疗结束后，接受联合治疗的小鼠的肿瘤用额外10天检测。植入HCT116CR细胞的小鼠的肿瘤生长速度比植入HCT116DM细胞的小鼠更快(p=0.03)。
DNA变异分析
所有8个细胞都对50个有名基因使用了离子放大器癌症热点小组v2，进行了DNA变异的筛选。测序平均深度为3792 +/_424次，基本覆盖98.53 0.01%。所有的HCT116和LoVo细胞的变异都是根据先前的报告和分析设计检测。检测4种额外的变异：HCT116AR细胞中SMAD4(Y412H)，HCT116CR细胞中TP53(T18A)和TP53(Y236C)以及LoVoDM细胞中PTEN(A126S)。
RNA表达分析
利用基因表达阵列，分别表达了11个探针(调节p小于0.01和折叠变化大于1.5)，以及与其他细胞相比，HCT116CR和LoVoCR细胞之间的一致性。内皮素1(EDN1)和转化生长因子beta 2(TGFB2)分别具有不同最高表达 (分别为3.84和3.94)，其中EDN1p值(分别为1.22*10 负9次方 and 2.44 *10负 6次方)。在CR和DM细胞之间的EDN1和TGFB2表达的显著差异通过实时PCR和西方免疫在HCT116和lovo衍生的细胞中的进行了验证。尤其感兴趣的是TGFB2和EDN1的表达增加，因为TGFB2可以通过SMAD激活上调EDN1 。在单药耐药的AQR 细胞，EDN1和TGFB2的表达没有改变，内皮素受体的表达在联合治疗AQR细胞保持不变与亲代细胞相比。
EDN1和TGFB2的调节
为调查EDN1是否涉及耐药，父系HCT116细胞在EDN1或拟似物中培养24小时，AZD6244和BKM120这两种药物在EDN1培养的细胞中具有拮抗作用，而它们在拟似物培养的HCT116细胞中有协同作用。EDN1培养的细胞有更高p-akt、p-erk和p-4ebp1的水平，比拟似物要高。
HCT116和HCT116CR细胞也转染EDN1和TGFB2 siRNA，并确认它们分别减少了EDN1和TGFB2 RNA水平。TGFB2 siRNA转染也减少了EDN1 RNA水平，而EDN1 siRNA转染并没有减少TGFB2 RNA水平，与TGFB2是EDN1的上游调节器相一致。在HCT116CR细胞中，EDN1 siRNA的转染导致了AZD6244和BKM120之间的协同作用(0.52 +/-0.03)，而阴性对照的细胞仍然存在拮抗作用 (2.1+/-0.05)。在父母的HCT116细胞中，这两种药物在与EDN1 siRNA(0.25 +/-0.04)或阴性对照siRNA(0.22 +/-0.02)仍有协同作用。类似地，转染TGFB2 siRNA(0.62+/- 0.08)，而不是阴性对照siRNA(1.9 +/-0.07)也在HCT116CR细胞中转变拮抗为协同。HCT116细胞中转染TGFB2 siRNA (0.49 +/-0.06)或siRNA(0.32 +/-0.05)协同治疗也没有改变。EDN1和TGFB2 siRNA也在HCT116CR细胞中降低了p-akt和p-erk的水平，但不是在HCT116细胞。同样的结果也被来自于lovo衍生细胞的EDN1和siRNA引发观察到。此外,使用波生坦,一种双重内皮素受体拮抗剂，在存在一个固定低增长的抑制浓度(5%增长抑制)， PI3K和MEK抑制剂之间的协同作用也在HCT116CR (CI@fu0.5 = 0.53 - 0.02,p < 0.05)和LoVoCR(CI@fu0.5 = 0.61 - 0.04,p < 0.05) 得到恢复。
探讨:
在本研究的执行过程中，有两项关于联合治疗AQR的对照研究报告。Ahronian等人描述了AQR对黑素瘤细胞的BRAF和MEK抑制剂的联合治疗，这与获得性KRAS扩增有关。KRAS扩增也在一个BRAF和MEK抑制剂联合治疗的黑色素瘤患者复发的肿瘤中发现。Pirazolli等人报道了阿法替尼和西妥西妥单抗的体内外联合治疗EGFR突变肺癌患者出现耐药与获得性mTOR激活有关。类似的耐药性和异常在使用阿法替尼和西妥西妥单抗治疗的肺癌患者中观察到。
然而，联合治疗的一个主要因素是药物相互作用的效果，是协同作用、添加作用还是拮抗作用。传统上，这种交互是由Chou和Talalay的协议来衡量的。该协议允许从浓度范围内的不同药物的IC50值计算出一个CI值。通过这一方法，可以量化联合药物相互作用的性质，并可避免协同只有增强的误解。
本研究的主要假设是，基于药物相互作用可以决定联合治疗疗效的基本原理，改变药物相互作用可能在联合治疗的AQR中发挥作用。为了验证这一假说，AQR的模型要么是AZD6244和BKM120联合(HCT116CR)，要么是AZD6244单独(HCT116AR)，或者是BKM120单独(HCT116BR)通过长期的治疗生成，以及使用DMSO拟似物(HCT116DM)治疗细胞。在支持该假说的基础上，CI值揭示了AZD6244和BKM120联合治疗在HCT116CR细胞中是拮抗的，而在HCT116DM细胞仍然存在协同作用。联合治疗在HCT116AR和HCT116BR细胞中仍有协同作用，表明在HCT116CR细胞中失去协同作用是AQR的一个特殊特性。此外，通路信号分析显示，单剂和联合治疗继续抑制所有细胞的预期靶点。这表明耐药不只是直接抑制活性的丧失。
这项研究中包含了许多措施来支持失去协同效应的验证。对于单药治疗，在IC50浓度中使用两倍药物治疗以提供与联合治疗相似的药物剂量。长期使用拟似物治疗的细胞被用来对照治疗的效果。使用MEK(GDC0973)或PI3K(BYL719)抑制剂治疗细胞，观察到类似的趋势，支持观察结果不是复合特定的。观察到LoVo细胞的平行系生成和类似的耐药模式，表明这些观察也不是特定于细胞株的。最后，肿瘤异种移植证实了体内的耐药表型。
研究设计揭示了联合和单药治疗AQR的许多不同之处。4EBP1的磷酸化唯独减少，而在HCT116CR细胞中AZD6244治疗减少了p-akt和p-4EBP1，而不是其他的细胞。除了在HCT116AR、HCT116BR和HCT116CR细胞中观察到的G1周期阻滞减少外，在联合治疗后的HCT116CR细胞中减少了细胞凋亡。与所有其他细胞相比，在HCT116CR细胞中，细胞迁移较少受到联合治疗的阻碍。虽然HCT116AR细胞对mTOR抑制剂更有耐药性，但HCT116CR细胞更敏感。这些额外的表型与联合治疗耐药是联合单药的耐药综合结果相冲突。
为了深入了解失去协同作用的潜在机制，对50个经常在癌症中突变的基因进行测序。在HCT116AR的SMAD4(Y412H)、LoVoAR的PTEN(A126S)和在HCT116CR细胞TP53(T18A)和TP53(Y236C)，检测到独特的DNA变异。所有这些变异都被认为是有害的，并且有可能被SIFT 和Polyphen 破坏。PTEN(A126S)的变异会部分灭活PTEN，因此可能激活PI3K信号，以补偿MEK通路抑制。假定p53在肿瘤抑制和应激反应中扮演的作用 ，因p53(18A)和TP53(Y236C)突变而灭活的p53可能涉及AQR。尽管如此，这些畸变在模型之间并不一致，从而引发了进一步的调查。
基因表达阵列分析显示，EDN1和TGFB2是HCT116CR和LoVoCR细胞中最主要的过表达候选基因，但在其他细胞中却没有。EDN1基因编码为内皮素-1，这是一种血管活性肽，通常与血管收缩和内皮功能联系在一起。内皮素-1与内皮素受体A和B结合，后者是G-蛋白偶联受体(GPCRs)，通过第二信使激活许多信号通路，包括MEK和PI3K通路。内皮素1也能触发蛋白质激酶C的激活，这直接导致Erk和Akt激活。TGFβ是一种众所周知的细胞因子，它可以通过激活SMAD家族蛋白来调节许多细胞过程，如增殖、分化、生存、粘附和迁移。有趣的是，对MEK和PI3K信号的抑制可以导致TGFβ激活，而EDN1是TGFβ/SMAD激活转录的下游靶点。
综之， HCT116CR和LoVoCR细胞联合治疗AQR的机制可以被理顺。可以假设，PI3K和MEK通路的联合抑制导致了TGFβ和随后的EDN1的激活。增加的内皮素-1然后提供了PI3K和MEK途径的补偿激活，从而导致了对联合治疗的耐药性。在支持这一假设的情况下，补充的内皮素-1改变了父系HCT116和LoVo细胞的联合治疗的协同作用，并激活Akt、Erk和4EBP1。静默EDN1或TGFB2，也改变了HCT116CR和LoVoCR细胞联合治疗的拮抗作用，降低了p-akt和p-erk的水平。另外，bosentan，双内皮受体抑制剂，在HCT116CR和LoVoCR细胞中恢复了BKM120和AZD6244之间的协同作用。
然而，目前尚不清楚药物相互作用的变化是如何发生的。从历史上来看，协同作用或拮抗作用可以被理解为增强或减少受体结合或酶活性，这是由两种药物联合而成的。在本研究中，没有一个共同的受体或酶，一种方法能够考虑到对MEK和PI3K通路的协调抑制以及其下游效应，如同药物相互作用于单一靶点。考虑到这一点，通过GPCRs/内皮-1上游激活MEK和PI3K通路，或者激活Erk和Akt下游的MEK和PI3K抑制，可以被看作是分离通路抑制和/或旁路抑制剂的效果，从而改变协同丢失。此外，内皮素-1还可以激活其他通路，通过多种通路来改变MEK和PI3K的下游信号。在联合治疗后的HCT116CR细胞的凋亡和迁移抑制的降低可能是这种效果的表现。HCT116CR细胞对Akt和mTOR抑制剂的意外敏感性可能预示着改变通路动力学，同时也强调了干预的潜在理由。
总之，这项研究的结果支持了一种假设，即药物的相互作用改变可以决定药物的联合治疗AQR。单药和联合治疗的AQR表现类型的差异表明，谨慎应用假设的联合治疗的耐药机制由单一药物治疗耐药机制确定。TGFB2-EDN1轴的过度表达被认为是一种潜在的MEK和PI3K抑制剂联合治疗协同丢失的潜在机制，观察这一机制是否在临床耐药性中发挥作用是很有意义的，因为这一联合的临床试验已经成熟。由于Chou和Talalay的协议只反映了相互作用的整体性质，而不是其组成部分，因此无法实现对药物相互作用的机制的精确描述。系统生物学特性描述了TGFB2-EDN1轴复杂的效应器和通路，这可能有助于进一步了解药物的相互作用如何在现代环境中影响药物耐药。
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马克，学习，谢谢
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